【摘 要】
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目的:本课题提取分离了原代人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,h PDLSCs),接种于负载有转化生长因子-β3(transforming growth factor-β3,TGF-β3)的壳聚糖海绵上,通过观察h PDLSCs在不同浓度TGF-β3/壳聚糖海绵上成骨分化的情况,探讨TGF-β3/壳聚糖海绵与h PDLSCs联合应用治疗牙槽骨
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目的:本课题提取分离了原代人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,h PDLSCs),接种于负载有转化生长因子-β3(transforming growth factor-β3,TGF-β3)的壳聚糖海绵上,通过观察h PDLSCs在不同浓度TGF-β3/壳聚糖海绵上成骨分化的情况,探讨TGF-β3/壳聚糖海绵与h PDLSCs联合应用治疗牙槽骨缺损的可能性。方法:1.采用酶解组织块法从人类牙周韧带组织中分离提取h PDLSCs,并通过形态学观察、流式细胞术、多向诱导分化实验等对其进行鉴定;2.采用四噻唑蓝(methylthiazoletetrazolium,MTT)法测定不同浓度(12~7500 ng/m L)TGF-β3对h PDLSCs增殖的影响;碱性磷酸酯酶(alkaline phosphatase,ALP)定量测活法探讨不同浓度TGF-β3对h PDLSCs成骨分化的影响;3.采用真空冷冻干燥法制备壳聚糖海绵材料,从表面形貌、吸水率、膨胀率、孔隙率考察复合材料的性能,并参照医疗器械生物学评价国家标准GB/T16886.5-1997对其进行初步的生物相容性评价;4.采用ALP染色及定量检测、邻甲酚酞络合酮法测定钙含量、蛋白质免疫印迹法(Western Blot,WB)检测成骨相关蛋白COLⅠ、COLⅡ、Runx2表达量以研究不同浓度(60~1500ng/m L)TGF-β3/壳聚糖海绵对h PDLSCs成骨分化的影响。结果:1.本实验提取的h PDLSCs纯化后可形成克隆集落,呈长梭形,高表达间充质干细胞表面标志物CD105、CD166、CD44和CD90,而造血干细胞标志物CD34、CD45和HLA-DR呈低表达。多向分化潜能鉴定结果表明所获得的h PDLSCs在特定的诱导条件下可向成骨、成脂、成软骨分化。2.MTT结果显示,实验浓度范围内TGF-β3不影响h PDLSC的增殖(vs blank control,P>0.05)。成骨诱导7 d后,各实验组ALP活性显著提升(vs blank control,P<0.05),其中TGF-β3(300ng/m L)组差异最显著(P<0.01),14 d后TGF-β3(1500ng/m L)组提高ALP活性最显著(P<0.001)。3.成功制备了壳聚糖海绵,其吸水率、膨胀率、孔隙率分别为(2347±201)%、(52.67±12.42)%和(95.65±3.5)%。Calcein-AM/PI染色显示,h PDLSCs在材料上可粘附定植,细胞铺展呈长梭形,细胞核及细胞骨架结构完整,核质胞质染色均匀。壳聚糖海绵浸提液组生物毒性分级为0级或1级,与空白对照组之间的差异无统计学意义(P>0.05)。4.接种在不同浓度(60~1500 ng/m L)TGF-β3/壳聚糖海绵上的h PDLSCs成骨诱导后发现:诱导7 d后TGF-β3(300ng/m L)组ALP活性最高(P<0.05,vs blank control);诱导21 d、28 d后TGF-β3各组钙含量显著增多,高剂量组(1500 ng/m L)最为显著(P<0.001,vs blank control)。WB检测结果显示,各观测点TGF-β3实验组成骨相关蛋白COLⅠ、COLⅡ、Runx2的表达量均显著高于空白对照组(P<0.05)。结论:1.本实验提取分离得到的h PDLSCs是具有多向分化潜能的间充质干细胞;2.实验浓度范围内TGF-β3不影响h PDLSCs的增殖,但60~1500 ng/m L的TGF-β3可促进h PDLSCs的骨向分化;3.所制备的壳聚糖海绵材料具有良好的吸水率、膨胀率和孔隙率,有利于种子细胞的粘附、铺展与生长,且生物安全性良好,符合生物材料的医用标准;4.负载TGF-β3浓度为60~1500 ng/m L的壳聚糖海绵可以促进h PDLSCs的成骨分化,二者联合应用有望用于牙槽骨缺损修复。
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