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沙门菌是一种重要的食源性病原菌,目前肠道沙门菌已报道有2600多个血清型,其中鼠伤寒沙门菌是引起食源性疾病最常见的沙门菌血清型之一。近年来,在全球报道的沙门菌血清型中,新出现了一种沙门菌血清型变种,是由鼠伤寒沙门菌缺乏Ⅱ相鞭毛抗原产生的单相变异体（抗原式为1,4,[5],12:i:-）,因此该沙门菌血清型称为鼠伤寒沙门菌单相变异体或沙门菌1,4,[5],12:i:-。在过去二十年里,沙门菌1,4,[5],12:i:-在畜禽、动物性食品和腹泻病人监测中的检出率迅速上升,已成为引起全球动物和人感染的最常见沙门菌血清型之一。在沙门菌1,4,[5],12:i:-引起的食源性疾病暴发事件中,13.1%是由食用猪肉或猪肉制品引起。据EFSA和ECDC统计显示,2019-2020年欧洲人类病例和猪源样品中沙门菌的多重耐药率分别为25.4%和38.4%,其中沙门菌1,4,[5],12:i:-是多重耐药极为严重的沙门菌血清型之一。因此建立快速准确地鉴定该血清型菌株的方法,并确定其流行趋势和耐药特征,对该病的流行病学调查与防控策略制定尤为重要。本研究基于沙门菌1,4,[5],12:i:-与鼠伤寒沙门菌的比较基因组学分析,建立了能够快速检测和区分两种血清型沙门菌的多重PCR方法,并利用该方法对江苏四家不同生猪养殖场进行沙门菌流行病学调查,并对分离到的沙门菌进行药物敏感性试验,分析其耐药情况。同时,将鉴定出的鼠伤寒沙门菌及其单相变异体进行全基因组测序,分析细菌的耐药基因和毒力基因等分子流行特征,为猪场沙门菌病的防控提供依据。1鼠伤寒沙门菌及其单相变异体多重PCR检测方法的建立本研究通过对Enterobase数据库中124株沙门菌1,4,[5],12:i:-和66株鼠伤寒沙门菌进行比较基因组学分析,发现启动鞭毛相变的hin基因在所有沙门菌1,4,[5],12:i:-菌株中缺失,而所有鼠伤寒沙门菌菌株都携带该基因,所以hin基因可以成为区分鼠伤寒沙门菌和沙门菌1,4,[5],12:i:-的靶标基因。此外,由于鼠伤寒沙门菌和沙门菌1,4,[5],12:i:-的mdh基因存在两个核苷酸位点的突变,所以mdh可以作为区分这两种血清型沙门菌与其它常见血清型沙门菌的靶标基因。因此,我们基于靶基因hin和mdh建立了一种快速检测鼠伤寒沙门菌及其单相变异体的多重PCR方法。根据mdh和hin序列设计了两对引物,PCR扩增片段大小分别为839bp和567bp。鼠伤寒沙门菌能同时扩增出mdh和hin基因,沙门菌1,4,[5],12:i:-仅能扩增出mdh基因,其他常见沙门菌不能扩增出mdh基因。该方法的最低检测限为10pg/μL的鼠伤寒沙门菌和沙门菌1,4,[5],12:i:-的基因组DNA。对前期实验室保存的98株鼠伤寒沙门菌及其单相变异体进行多重PCR鉴定,共鉴定出40株鼠伤寒沙门菌以及58株沙门菌1,4,[5],12:i:-,多重PCR鉴定结果与全基因组测序结果完全一致。本研究建立的多重PCR方法,具有高度的特异性与灵敏度,能够直接鉴定并区分鼠伤寒沙门菌及其单相变异体。2生猪养殖场中鼠伤寒沙门菌及其单相变异体的流行病学调查本研究对江苏一家规模化生猪育种企业的四个猪场进行沙门菌流行病学调查,共采集911份样品,分离得到214株沙门菌,总分离率为23.5%。四个猪场的沙门菌分离率分别为25.2%、5.1%、35.2%和3.3%。统计学分析显示,公猪舍的沙门菌分离率显著高于育肥舍、保育舍和产房舍的沙门菌分离率（P＜0.01）,育肥舍的沙门菌分离率显著高于保育舍和产房舍的沙门菌分离率（P＜0.01）。使用本研究建立的多重PCR方法对214株分离株进行鉴定,其中2株能同时扩增出hin和mdh基因,鉴定为鼠伤寒沙门菌,31株仅能扩增出mdh基因,不能扩增出hin基因,鉴定为沙门菌1,4,[5],12:i:-,其他菌株均扩增不出mdh基因,血清学鉴定结果与多重PCR鉴定结果一致。全基因组测序进一步证实了多重PCR鉴定的血清型结果正确。此外,31株沙门菌1,4,[5],12:i:-的ST型均为ST34,2株鼠伤寒沙门菌的ST型均为ST19。同时对四个猪场分离到的214株沙门菌进行药物敏感性分析,结果显示所测菌株对四环素和复方新诺明的耐药率最高,分别为96.7%和93.5%,仅有两株沙门菌对环丙沙星耐药,三株沙门菌对头孢噻肟耐药,且所有菌株均对美罗培南敏感。本次实验分离的鼠伤寒沙门菌和沙门菌1,4,[5],12:i:-均为多重耐药菌株,其中耐药谱为AMP-CHL-FFC-K-NA-SXT-TE的菌株占比最大,为41.9%。系统发育分析结果显示,33株鼠伤寒沙门菌及其单相变异体菌株可分为2个大的分支,第一个大分支（Cluster A）只包含两株ST19的鼠伤寒沙门菌,而31株沙门菌1,4,[5],12:i:-属于另一大分支（Cluster B）。Cluster B可以进一步分为两个子分支（Cluster B.1和Cluster B.2）,其中Cluster B.1仅包含了三株来自C猪场的沙门菌1,4,[5],12:i:-,另一分支（Cluster B.2）的28株沙门菌1,4,[5],12:i:-均来自A场和C场,且亲缘关系相近,揭示其可以随着生猪的运输在不同场之间交叉污染。耐药基因分析结果显示blaTEM-1B、blaCMY-2和tet（M）基因只存在Cluster A中,而tet（B）和ARR-3基因只存在Cluster B中。进一步分析显示strA、strB、blaCTX-M-65、blaOXA-10、dfrA14和mcr-1基因只存在Cluster B.1中。此外,我们还分析了 7种常见毒力基因在鼠伤寒沙门菌及其单相变异体中的分布情况,结果显示,31株沙门菌1,4,[5],12:i:-均携带两种毒力基因,分别为sodC1和gipA,而2株鼠伤寒沙门菌只携带sodC1基因。本研究从耐药表型和基因型,毒力基因等多角度阐明了猪场鼠伤寒沙门菌和沙门菌1,4,[5],12:i:-的流行特征,并进一步揭示了 Cluster B.2中的沙门菌1,4,[5],12:i:-为猪场优势克隆群,为猪场沙门菌病的防控策略制定提供了依据。