论文部分内容阅读
目的：细胞自噬(Autophagy)是真核细胞特有的生命现象,是高度保守的自我消化过程,在维持正常细胞的内稳态及细胞内蛋白质代谢的平衡中发挥着重要的作用。FIP200(focal adhesion kinase family interacting protein of 200kD),是分子量大小为200kD的黏着斑激酶家族相互作用蛋白。FIP200是细胞自噬起始复合蛋白中的一个重要调控蛋白。ULK1-Atg13-FIP200复合体在细胞自噬起始过程中起着重要作用。microRNA是一类高度保守、长度很短的非编码调控单链RNA,约18-24个核苷酸,通过与目标mRNA互补配对导致mRNA降解或抑制转录后翻译诱导基因沉默。miRNA参与生命活动中多步重要进程,包括发育、分化、器官形成、衰老、凋亡、增殖、和癌症的发生发展。目前,尚未有研究报道microRNA对FIP200的作用,本课题研究通过筛选靶向于FIP200的mircoRNA,并探讨后者与乳腺癌细胞自噬的作用,阐明乳腺癌细胞中miRNA 与 FIP200的关系。方法：(1)筛选和鉴定直接调控FIP200表达的miRNA:为筛选出靶向于FIP200的microRNAs，本项目采用生物信息学软件,分别有TargetScan、PicTar 和 miRanda,根据多个软件预测出靶向于FIP200的microRNAs,选出共同预测到的10个nicroRNAs;采用pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR载体分别构建以上10个microRNAs,采用siCHECKTM-2 dual luciferase reporter plasmi d载体构建FIP200 3’UTR和FIP200 3’UTR Mutant表达载体,将FIP200-3’UTR 和 microRNA表达载体共转染乳腺癌细胞MCF7、MDB-MA-231,肺癌细胞A549,宫颈癌细胞Hela,肝癌细胞HepG2,通过双萤光报告系统在不同细胞中随机验证筛选出下调FIP200的microRNAs共3个miR20a、miR20b和niR302a,进一步Western结果显示过表达这些miRNA可以显著降低FIP200蛋白表达的有两个：miR20a和niR20b。(2)进一步确认筛选出的miRNAs对细胞自噬的调控：microRNAs的过表达,验证FIP200的下调是否会抑制细胞自噬水平,本研究建立雷帕霉素(Rapamycin)诱导的细胞自噬模型,通过以下三种方法：Westemblotting检测细胞自噬标志蛋白LC3-Ⅱ的表达水平,激光共聚焦显微镜观察细胞自噬小体荧光颗粒的聚集,透射电镜观察自噬小体的结构：siRNA干扰FIP200的表达,验证microRNAs对细胞自噬的下调是否通过下调FIP200的表达来完成。(3)研究在乳腺癌细胞中micro RNA与FIP200的关系：为了验证我们的结论,我们分别检测了乳腺癌细胞和正常乳腺细胞中内源性miR20a、miR20b和FIP200的表达水平。确认在细胞内miR20a以及miR20b与FIP200的关系。结果：生物信息学软件分析说明FIP200 3’UTR有多个microRNAs的种子序列能与其结合。我们选取多个软件共同预测到的并且种子序列与靶基因完全配对的10个microRNAs,分别为miR20a、miR20b、miR106b、miR133a、miR133b、miR302a、miR302b、 miR302c、 miR302d和miR372,在多个细胞系中随机验证,通过双荧光报告系统结果显示miR20a、miR20b、miR106b、miR302a、miR302b、miR302c、miR302d能抑制FIP200的表达。Western blotting结果显示,在乳腺癌细胞中过表达以上miRNAs,其中miR20a和miR20b能显著抑制FIP200蛋白的水平。我们的结果证明1niR20a和miR20b能调控FIP200的蛋白表达,进一步在细胞自噬模型中通过Western检测细胞自噬标志蛋白LC3、激光共聚焦显微镜观察细胞自噬小体荧光颗粒的聚集、透射电镜观察自噬小体的结构,验证了miR20a和miR20b能通过靶向于FIP200抑制细胞自噬水平。此外,我们检测了人类正常乳腺细胞和乳腺癌细胞中miR20a和miR20b的内源性表达水平,real time PCR结果显示,miR20a和miR20b在乳腺癌细胞中的表达水平显著低于正常细胞中的表达水平,Western结果显示FIP200在乳腺癌细胞中高表达。这为我们通过miR20a和miR20b来治疗乳腺癌提供了新的思路。结论：(1)miR20a和miR20b能够抑制靶基因FIP200的表达。(2)miR20a和miR20b能抑制乳腺癌细胞中的细胞自噬水平。(3)miR20a和miR20b在乳腺癌细胞中低表达。(4)FIP200在乳腺癌细胞中高表达。