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研究背景:结核病(Tuberculosis,TB)的发生是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)和宿主免疫细胞相互作用的一个复杂过程。机体对Mtb感染的免疫机制和TB的发病机制并未完全阐明。近年来,具有天然免疫样作用的γδT细胞在Mtb感染中的免疫作用,已得到众多研究者实验研究和临床观察的证实。然而,对γδT细胞所能识别抗原的研究多集中于磷酸类抗原,有关肽类表位的研究很少。但是,近期已有研究者报导γδT细胞识别人工合成多肽序列,本实验室近期经噬菌体随机多肽展示库技术筛选获得γδT细胞识别的多肽序列,其人工合成片段也可激活γδT细胞,证实了γδT细胞可以像B细胞一样直接识别多肽表位。但γδT细胞是否也能识别B细胞所识别的表位,尚未见报道。基于此,本研究应用多肽表位人工合成片段体外刺激培养人外周PBMC后用流式细胞术分析Mtb-Ag中B细胞表位多肽能否特异性刺激γδT细胞的活化和增殖,以寻找更多的γδT细胞特异性表位多肽。也为抗Mtb感染的新型疫苗的研发提供一个新的方向。目的:探讨Mtb抗原肽类表位能否特异性刺激γδT细胞。方法:1.根据文献报道,选取Mtb蛋白抗原中的6条B细胞表位多肽序列;以及本实验室前期工作所得选取7条T细胞表位多肽序列,人工合成多肽片段。多肽人工合成片段采用PBS稀释至1 mg/ml,过滤除菌后备用。2.将B细胞表位人工合成多肽片段包被在ELISA微孔板上,将健康人和结核患者血清,以不同稀释度(1:3和1:9)加入微孔板中,加酶标二抗(羊抗人Ig G-HRP),洗涤后,再加底物显色,用酶标仪检测各孔显色的吸光度值(OD值),并与阴性孔对照和计算。3.将表位多肽作用于健康人PBMC,计算其刺激人外周血PBMC后,γδT细胞的增殖百分率;并利用CFSE染色技术观察γδT细胞增殖代数,检测表位肽对γδT细胞的特异性活化增殖作用。4.收集各组培养的细胞,用荧光抗体进行细胞表面抗原染色,包括CD3、TCRγδ、Vδ1、Vδ2,流式细胞术检测,所得数据采用Flowjo软件分析。5.将表位多肽优势扩增出的γδT细胞,分两份,每份分成三组,分别以等量对应多肽、不加多肽和等量无关多肽,刺激18小时后收取一份通过表面抗原染色,检测表达CD69细胞的百分率;另一份加入Mo(终浓度为1μg/ml)封闭4小时后,收取细胞先表面抗原染色后再细胞内染色干扰素-γ(IFN-γ),检测表达IFN-γ细胞的百分率。6.将表位多肽优势扩增出的γδT细胞,通过RT-PCR技术得到PCR产物经过扫描,分析各自的优势峰分布特点。结果:1.ELISA结果显示16例健康人和4例结核患者血清以1:3和1:9的稀释度,加入包被B细胞表位多肽的微孔板。其OD值(OD450)大于阴性对照(cut off value,COV)2倍,均可与6条B细胞表位多肽结合。可以证明从文献中选取的6条多肽是B细胞表位多肽。2.人外周血PBMC经Mtb-Ag B细胞表位6条多肽和T细胞表位7条多肽刺激培养12天后,流式细胞仪检测和分析增殖细胞(CD3+、TCRγδ+)的百分率。用Wilcoxon符号秩检验将各组与阴性对照进行配对样本比较,发现22例γδT细胞增殖百分率结果中BP2(5.8)、BP3(6.2)、BP4(6.3)、BP5(6.3)、TP13(5.4)、TP14(5.8)、TP15(5.6)、TP16(5.8)和Mtb-HAg(38.3)组与阴性对照(4.4)组比较明显增高,差异有统计学意义(P值分别为0.008、0.044、0.007、0.049、0.044、0.003、0.022、0.005和0.000)。3.CFSE标记的PBMC经上述表位多肽刺激培养12天后,流式细胞仪检测和分析γδT细胞增殖(CD3+、TCRγδ+、CFSE-Low)的比例。用上述统计方法统计发现7例γδT细胞增殖指数在BP2(3.9)、BP4(3.7)、BP5(4.2)、BP6(3.7)、TP14(3.7)、和TP15(3.8)组与阴性对照组(2.0)比较明显增高,差异有统计学意义(P值分别为0.018、0.018、0.028、0.028、0.018和0.018)。与此同时,分析αβT细胞增殖(CD3+、TCRγδ-、CFSE-Low)的比例。用上述统计方法统计发现7例αβT细胞增殖指数结果中各组统计差异无显著性(P>0.05)。4.人外周血PBMC经上述表位多肽刺激培养12天后,流式细胞仪检测和分析增殖细胞(CD3+、TCRγδ+、Vδ1+和CD3+、TCRγδ+、Vδ2+)的百分率。用上述统计方法统计发现8例γδT细胞Vδ1亚群增殖百分率结果中BP1(5.8)、BP2(5.6)、BP3(5.4)、TP13(4.8)、TP15(5.4)、TP18(4.8)和TP23(7.1)组与阴性对照(3.4)组比较明显增高,差异有统计学意义(P值分别为0.05、0.05、0.05、0.036、0.036、0.036和0.036)。统计27例γδT细胞Vδ2亚群增殖百分率发现BP6(45.0)组与阴性对照(50.1)组比较明显降低,差异有统计学意义(P值为0.039,说明BP6非优势刺激Vδ2亚群。Mtb-HAg(84.8)组与阴性对照(50.1)组比较明显增高,差异有统计学意义(P值为0.000)。5.表位多肽优势扩增出的γδT细胞,再刺激后发现对应多肽刺激组比两个对照组的表达CD69的细胞百分率和产生IFN-γ的细胞百分率增高。6.表位肽优势扩增出的γδT细胞,通过RT-PCR技术和基因扫描分析,发现其TCR-Vδ-CDR3基因片段的分布呈寡克隆模式,而阳性对照Mtb-HAg扩增的γδT细胞的Vδ-CDR3基因片段呈多克隆分布模式。结论:1.来自Mtb抗原中的B细胞表位肽和γδTCR识别的肽片段均可激活γδT细胞增殖,但在不同个体间存在有差异。2.经Mtb抗原的表位肽激活扩增的γδT细胞被相同肽表位再刺激后,特异性活化分子CD69表达上调,并诱导产生效应性细胞因子IFN-γ。3.经Mtb抗原肽表位激活扩增的γδT细胞,其TCRVδ-CDR3片段分布呈寡克隆性。4.Mtb抗原肽表位激活的γδT细胞具有克隆特异性。