研究背景三氯乙烯（trichloroethylene,TCE）作为一种优良的工业有机溶剂被广泛应用于金属表面处理、石蜡萃取及制冷剂、干洗剂的生产等。在东南亚和我国广东地区因职业接触TCE所引起的职业性三氯乙烯药疹样皮炎严重威胁职业人群健康;且因其广泛的工业应用致使TCE大量进入到环境中,严重污染空气、水源和土壤。环境中的TCE可以通过生物蓄积作用进入机体发挥毒性作用,对人体和其他生物体皮肤和脏器的损伤已被广泛证实,其中受累脏器以肝脏最为多见。有研究表明,TCE及其代谢产物会引起表观遗传变化,从而改变免疫功能并促进肝脏炎症反应。肝巨噬细胞在炎症反应过程中可被迅速激活并向不同方向极化,根据所处微环境中不同成分的刺激,肝巨噬细胞主要极化为两种亚型,包括促炎的M1型和抗炎的M2型。M1型肝巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）等细胞因子,M2型肝巨噬细胞分泌白介素-10、转化生长因子-β等细胞因子。与M1型或M2型激活相关的表观遗传调控主要依赖于炎症相关基因启动子区域的组蛋白修饰,在巨噬细胞极化的信号调节和传导过程中发挥重要作用。多种组蛋白修饰酶可催化组蛋白尾部精氨酸和赖氨酸的翻译后修饰,招募效应蛋白的结合,影响下游蛋白,进而参与特定的细胞过程,其中组蛋白赖氨酸去甲基化酶KDM4A与巨噬细胞的激活相关。研究目的本研究的研究目的是通过建立TCE经口暴露小鼠模型和RAW264.7细胞染毒模型,结合使用KDM4A抑制剂JIB-04,检测小鼠TCE经口暴露过程中在肝脏内KDM4A、组蛋白H3K9甲基化指标H3K9me3/2/1、巨噬细胞标志F4/80、M1型巨噬细胞标志CD11c、诱导型一氧化氮合酶（Inducible Nitric Oxide Synthase,i NOS）及细胞因子TNF-α和IL-1β的表达情况,并探索巨噬细胞促炎关键信号通路β-catenin的活化情况,从而进一步探讨TCE肝损伤的机制。研究方法96只SPF级BALB/c小鼠,雌性,6-8周龄,适应性喂养1周后,将小鼠随机分为4组:2.5 mg/ml TCE组、5.0 mg/ml TCE组、溶剂对照组、空白对照组。分别在第2、4、8、12周四个时点根据实验要求完成取材。取小鼠血清测定肝功能（指标ALT和AST）。取小鼠肝脏组织制作成石蜡切片,通过苏木素-伊红染色（HE染色）观察肝脏病理损伤情况;免疫荧光双标检测小鼠肝脏F4/80与CD11c表达及重合情况;免疫组织化学法检测小鼠肝脏i NOS沉积情况。取小鼠肝脏组织提取蛋白原液,通过蛋白免疫印迹法检测小鼠肝脏KDM4A、H3K9me3/2/1、CD11c、TNF-α、IL-1β、β-catenin蛋白表达水平。细胞实验设空白对照组、溶剂对照组、JIB-04抑制剂对照组、TCE处理组、TCE+JIB-04抑制剂组。染毒处理并培养24小时后,刮取细胞并收集细胞培养上清液。提取细胞蛋白原液,通过蛋白免疫印迹法检测细胞中KDM4A、H3K9me3/2/1、CD11c、β-catenin蛋白表达水平。取细胞培养上清液,通过ELISA法检测细胞上清液中TNF-α、IL-1β水平。研究结果1.试验期间各组小鼠状态良好,没有出现因TCE染毒而死亡的个体,每天平均耗水量为0.13 ml/g,2.5 mg/ml TCE组和5.0 mg/ml TCE组平均暴露量为357.03 mg/kg/d和657.62 mg/kg/d。各时间点小鼠体重增长及肝脏系数的组间差异没有统计学意义。2.小鼠肝脏HE染色结果可以看出,空白对照组和溶剂对照组的肝细胞排列整齐,胞核大而圆,核仁明显,胞质均匀,无炎性改变;而2.5 mg/ml TCE组和5.0 mg/ml TCE组肝脏组织汇管周围有明显炎细胞浸润,部分区域可见细胞空泡样变性,少许细胞变性或坏死,胞质疏松,细胞形态异常。3.小鼠肝脏透射电镜观察结果显示:空白对照组和溶剂对照组无明显组织形态学变化。而2.5 mg/ml TCE组和5.0 mg/ml TCE组肝细胞内出现大量空泡,糖原颗粒减少,线粒体水肿、内嵴结构紊乱、数量减少,内质网互相离散、断裂成大小不等的片段。4.小鼠肝功能测定结果统计分析显示,在第2、4、8、12周,溶剂对照组小鼠血清AST和ALT水平与空白对照组比较差异均无统计学意义;在第2周,2.5mg/ml TCE组AST和ALT水平较空白对照组有明显升高;在第4、8周,5.0 mg/ml TCE组AST和ALT水平较空白对照组和溶剂对照组有所升高,且5.0 mg/ml TCE组AST和ALT水平高于2.5 mg/ml TCE组;在第12周,2.5 mg/ml TCE组和5.0mg/ml TCE组AST和ALT水平有所下降,但仍高于对照组。5.通过免疫荧光双标对巨噬细胞活化的重要指标F4/80与M1型巨噬细胞表面标记物CD11c进行共定位,结果显示:在第2、4、8、12周,空白对照组和溶剂对照组F4/80与CD11c表达较少,2.5 mg/ml TCE组和5.0 mg/ml TCE组F4/80与CD11C表达阳性区域较多。6.通过蛋白免疫印迹法再次验证了CD11c的蛋白表达水平,结果显示:与空白对照组相比,2.5 mg/ml TCE组和5.0 mg/ml TCE组CD11c蛋白表达水平升高,差异具有统计学意义。7.通过免疫组织化学法检测了M1型巨噬细胞标记物i NOS的表达情况,结果显示:空白对照组和溶剂对照组i NOS表达极少,而2.5 mg/ml TCE组和5.0 mg/ml TCE组i NOS出现大量沉积。8.通过蛋白免疫印迹法检测小鼠肝脏TNF-α和IL-1β的蛋白表达水平,结果显示:与空白对照组相比,2.5 mg/ml TCE组和5.0 mg/ml TCE组中TNF-α和IL-1β的蛋白表达水平升高,差异有统计学意义。9.通过蛋白免疫印迹法检测小鼠肝脏KDM4A和H3K9me3/2/1的蛋白表达水平,结果显示:与空白对照组相比,2.5 mg/ml TCE组和5.0 mg/ml TCE组中KDM4A的蛋白表达水平升高,而H3K9发生去基化（2.5 mg/ml TCE组和5.0 mg/ml TCE组中H3K9me3/2的蛋白表达水平降低,而H3K9me1的蛋白表达水平升高）,差异有统计学意义。10.通过蛋白免疫印迹法检测了小鼠肝脏中β-catenin的表达情况,结果显示:与空白对照组相比,2.5 mg/ml TCE组和5.0 mg/ml TCE组中β-catenin的蛋白表达水平升高,差异有统计学意义。11.通过蛋白免疫印迹法检测小鼠巨噬细胞RAW264.7中KDM4A、H3K9me3/2/1、CD11c和β-catenin的蛋白表达水平,结果显示:与空白对照组和溶剂对照组相比,TCE处理组KDM4A的蛋白表达水平升高,而H3K9发生去基化（TCE处理组中H3K9me3/2的蛋白表达水平降低,而H3K9me1的蛋白表达水平升高）,差异有统计学意义。当存在KDM4A抑制剂JIB-04的情况下,可降低KDM4A蛋白表达水平,H3K9me3/2的整体去甲基化在很大程度上得到了挽救。12.通过双抗体夹心法检测了小鼠RAW264.7巨噬细胞上清液中TNF-α、IL-1β等M1型促炎细胞因子的水平,结果显示:空白对照组、溶剂对照组及JIB-04抑制剂对照组的TNF-α和IL-1β水平差异无统计学意义。与以上三组相比,TCE处理组中TNF-α和IL-1β的表达增加。而TCE+JIB-04抑制剂组中TNF-α和IL-1β的表达降低,且差异有统计学意义。研究结论1.在TCE经口暴露诱导小鼠肝巨噬细胞M1型极化,促进肝脏炎性因子表达的过程中,组蛋白赖氨酸去甲基化酶KDM4A蛋白表达水平升高,H3K9发生去甲基化,激活β-catenin信号通路。2.外源性KDM4A抑制剂（JIB-04）可抑制TCE诱导的H3K9去甲基化,抑制巨噬细胞M1型极化和β-catenin信号通路的活化。