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生物靶标蛋白的重组制备及其抑制剂的筛选在各类疾病防治方面具有十分重要的地位。本论文以靶标蛋白绿盲蝽多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase, PG)和人细胞质来源的天冬氨酸氨基转移酶(Glutamic-oxaloacetic transaminase, GOT)为研究对象,探索了它们的重组制备与抑制剂筛选策略。绿盲蝽多聚半乳糖醛酸酶是绿盲蝽唾液分泌的瓦解植物细胞壁的关键酶,是植物致病因子之一,抑制该酶活性能降低绿盲蝽等昆虫对植物的破坏作用。人细胞质来源的天冬氨酸氨基转移酶是催化癌症细胞能量供给途径的关键酶。抑制该酶活性能抑制癌细胞的生长。(一)绿盲蝽多聚半乳糖醛酸酶基因的克隆、表达及生物信息学分析从绿盲蝽成虫中克隆得到一个多聚半乳糖醛酸酶基因AL-PG,其碱基序列为1050bp,编码350个氨基酸。获得的该碱基序列与美国豆荚草盲蝽(lygus hesperus) PG具有很高的同源性,碱基序列一致性为93%。该基因编码蛋白有氨基端疏水信号肽序列(MKFTIY ALGLLVAVAS A)。预测的成熟肽相对分子质量为35.9KDa,等电点为8.89。该蛋白二级结构由大量的B-折叠、B-转角和无规则卷曲组成,而a-螺旋的数量却非常少。其三级结构是右手平行的B螺旋结构,包含4组B折叠,PB1,PB2a, PB2b和PB3。催化氨基酸残基Asp153,Asp173和Asp174在底物结合裂缝的底部,底物结合裂缝入口的最小距离为8.4A。研究还证明该蛋白在毕赤酵母表达系统中不表达。(二)天冬氨酸氨基转移酶的重组制备与抑制机理分析人细胞质来源天冬氨酸氨基转移酶在大肠杆菌细胞中得到了可溶性表达,通过HisTrapTM FF crude column与HiTrapTM Q XL column阴离子交换层析得到电泳纯度的蛋白。SDS-PAGE显示分子量约为43KDa,收率为18.3%。纯化产物具有很好的活性,在25～50℃,pH3.0～10.0均比较稳定,最适温度45℃,最适pH9.0。筛选到氨基氧乙酸对该酶有很强的抑制作用,IC50值为2.16μM。分子对接结果显示,Trp141、His190、 Ala193、Asp223、Ser224、Arg225氨基酸残基形成该酶的活性口袋。氨基氧乙酸分子与His190、Ala193、Ser224和Ala225氨基酸残基之间形成氢键作用,从而使其紧密地结合在该酶的活性口袋中。它能竞争性抑制酶与底物的结合,表现出较强的抑制作用。