目的:通过实验研究确定朱砂安神丸(Zhusha-anshen-wan,ZS ASW)拮抗创伤后应激障碍(Posttraumatic Stress Disorder,PTSD)及其所致睡眠障碍的作用及作用机制。方法:第一部分:朱砂安神丸对PTSD大鼠场景恐惧消退的影响一、朱砂安神丸对PTSD大鼠场景恐惧习得、消退和消退保持的影响(恐惧消退范式一)SD雄性大鼠50只,随机将其分为假操作组、模型组、阳性药(哌唑嗪)组、朱砂安神丸(ZS AS W)高、低剂量组,每组10只动物。单程长时应激(Single prolonged stress,SPS)法复制PTSD模型。实验第8日起开始药物干预,朱砂安神丸高、低剂量按1.08 g/kg和0.54g/kg,哌唑嗪剂量按O.5mg/kg每日一次灌胃给药,共给药6天,假操作组和模型组给予相应体积蒸馏水。条件性恐惧实验监测系统记录大鼠僵直时间,以此作为观察指标研究朱砂安神丸对PTSD大鼠场景恐惧习得、消退和消退保持的影响。二、朱砂安神丸联合多次消退训练对大鼠场景恐惧消退的影响(恐惧消退范式二)SD雄性大鼠50只,随机将其分为假操作组、模型组、阳性药(哌唑嗪)组、朱砂安神丸高、低剂量组,每组10只动物。SPS法复制PTSD模型。实验第9日起开始消退训练,同时开始药物干预,朱砂安神丸高、低剂量按1.08 g/kg和0.54 g/kg,哌唑嗪剂量按0.5 mg/kg每日一次灌胃给药,共给药5天,假操作组和模型组给予相应体积蒸馏水。条件性恐惧实验监测系统记录大鼠5次消退训练的僵直时间,以此作为观察指标研究朱砂安神丸对PTSD大鼠场景恐惧消退的影响。三、朱砂安神丸对PTSD大鼠自主活动的影响SD雄性大鼠60只,随机将其分为空白对照组,朱砂安神丸高、低剂量组、SPS模型组,SPS+ZSASW高剂量组、SPS+ZSASW低剂量组,每组10只动物。实验第8日起开始药物干预,朱砂安神丸高、低剂量按1.08 g/kg和0.54 g/kg,每日一次灌胃给药,共给药6天,空白对照组和SPS模型组给予相应体积蒸馏水。以大鼠在开野实验箱中的运动时间和运动距离为评价指标来研究朱砂安神丸处置和SPS应激两个因素间的交互作用和主效应。第二部分:朱砂安神丸对PTSD大鼠睡眠的影响一、实验动物监测系统睡眠探测分析模块用于分析大鼠睡眠模式的方法评价SD雄性大鼠20只,随机将其分为脑电图(EEG)睡眠分析组和实验动物监测系统(CLAMS)睡眠分析组,每组10只动物。分别用CLAMS动物监测系统和皮层脑电图对正常大鼠睡眠进行记录和分析,以大鼠睡眠时间(Sleep time,ST)、觉醒次数(Awakening number,AN)和短时觉醒次数(Brief awakening number,bAN)为评价指标,比较两种方法在分析睡眠相关指标上的差异。二、建立筛选共病睡眠障碍PTSD大鼠的方法SD雄性大鼠60只,随机将其分为空白对照组和应激暴露组,空白对照组20只大鼠,应激暴露组40只大鼠。应激暴露组大鼠接受SPS应激,以大鼠在新异环境中的僵直时间作为评价指标将暴露组大鼠分为高反应(High response,HR)和低反应(Low response,LR)两个亚组。利用CLAMS系统记录大鼠睡眠,以大鼠睡眠时间、觉醒次数和短时觉醒次数为评价指标,研究HR和LR大鼠睡眠模式的差异性,并对大鼠僵直时间(在新异环境中的僵直时间)与睡眠指标的相关性进行分析。三、朱砂安神丸对PTSD大鼠睡眠的影响SPS法复制PTSD模型动物,以动物在新异环境中的僵直时间为依据筛选出高反应(HR,Freezing>60%)大鼠(雄性SD大鼠)40只,体重均衡下随机分为四组,即模型组、阳性药(哌唑嗪)组、朱砂安神丸高、低剂量组,每组10只动物,另设一组空白对照组(不接受SPS应激)。实验第8日起开始药物干预,朱砂安神丸高、低剂量按1.08 g/kg和0.54 g/kg,哌唑嗪剂量按0.5 mg/kg每日一次灌胃给药,共给药6天,空白对照组和模型组给予相应体积蒸馏水。利用CLAMS系统记录分析大鼠睡眠,以大鼠睡眠时间、觉醒次数和短时觉醒次数为评价指标,研究朱砂安神丸对PTSD大鼠活动相(暗相)及睡眠相(明相)睡眠模式的影响。第三部分:基于LC-NA神经系统的朱砂安神丸改善PTSD大鼠恐惧消退障碍和睡眠障碍的神经生物学机制研究一、基于LC-NA神经系统的朱砂安神丸改善PTSD大鼠恐惧消退障碍的神经生物学机制研究SD雄性大鼠65只,随机将其分为假操作组、模型组、阳性药(哌唑嗪)组、朱砂安神丸高、低剂量组,每组1 3只动物。SPS法复制PTSD模型。实验第8日起开始药物干预,朱砂安神丸高、低剂量按1.08 g/kg和0.54 g/kg,哌唑嗪剂量按0.5 mg/kg每日一次灌胃给药,共给药6天,假操作组和模型组给予相应体积蒸馏水。条件性恐惧实验监测系统记录并分析大鼠僵直时间,以此作为观察指标研究朱砂安神丸对PTSD大鼠场景恐惧习得、消退和消退保持的影响。利用荧光定量聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)和荧光免疫组化技术,以大鼠脑组织内酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)、促肾上腺皮质激素释放激素受体1(Corticotropin releasing factor receptor-1,CRFR1)、促肾上腺皮质激素释放激素(Corticotropin releasing factor,CRF)为指标,研究朱砂安神丸对以上指标的干预作用。二、基于LC-NA神经系统的朱砂安神丸改善PTSD大鼠睡眠障碍的神经生物学机制研究SPS法复制PTSD模型动物,以动物在新异环境中的僵直时间为依据筛选出高反应(HR,Freezing>60%)大鼠52只(SD雄性大鼠),HR大鼠随机分为四组,即模型组、阳性药(哌唑嗪)组、朱砂安神丸高、低剂量组,每组13只,另设一组空白对照组(不接受SPS应激)。实验第8日起开始药物干预,朱砂安神丸高、低剂量按1.08 g/kg和0.54 g/kg,哌唑嗪剂量按0.5 mg/kg每日一次灌胃给药,共给药6天,空白对照组和模型组给予相应体积蒸馏水。利用CLAMS系统记录大鼠睡眠,以大鼠睡眠时间、觉醒次数和短时觉醒次数为评价指标,研究朱砂安神丸对PTSD大鼠活动相(暗相)及睡眠相睡(明相)睡眠模式的影响。利用荧光定量PCR和荧光免疫组化技术,以大鼠脑组织内TH、CRFR1、CRF及尿液中皮质酮(Corticosterone,CORT)为观察指标,研究朱砂安神丸对以上指标的干预作用。结果:第一部分:朱砂安神丸对PTSD大鼠场景恐惧消退的影响一、朱砂安神丸对PTSD大鼠场景恐惧习得、消退和消退保持的影响(恐惧消退范式一)在场景恐惧习得和消退实验中,各组大鼠的僵直时间均无显著性变化。在消退保持测试中,在消退的第1 min内,与假操作组比,模型组动物僵直时间明显高于假操作组(P<0.01),两者比较有显著性差异。与模型组相比,阳性药组和ZSASW高剂量组大鼠僵直时间明显降低,与模型组比较有显著性差异(P<0.05和P<0.01)。二、朱砂安神丸联合多次消退训练对大鼠场景恐惧消退的影响(恐惧消退范式二)实验结果表明:与假操作组相比,10～14日的消退训练中模型组动物僵直时间均明显高于假操作组(P<0.05或P<0.01)。与模型组相比,阳性药组僵直时间在第12、13和14日明显减少(P<0.05);ZSASW高剂量组大鼠在第13和第14日僵直时间明显减少(P<0.05和 P<0.01)。三、朱砂安神丸对PTSD大鼠自主活动的影响开野实验结果表明:对大鼠的活动距离的影响,SPS应激和朱砂安神丸两因素之间没有交互作用(F(2,53)=1.244,P=0.2965)。SPS 应激处理(F(1,53=0.001494,P=0.9693)和药物处理(F(2,53)=0.5326,P=0.5902)的主效应均无统计学意义。对于大鼠运动时间的影响,SPS应激和朱砂安神丸处理两因素之间没有交互作用(F(2,53)=2.639,P=0.0808);SPS 应激处理(F(1,53)=0.9319,P=0.3388)和药物处理(F(2,53)=0.8356,P=0.4392)的主效应均无统计学意义。第二部分:朱砂安神丸对PTSD大鼠睡眠的影响一、实验动物监测系统睡眠探测分析模块用于分析大鼠睡眠的方法评价EEG组动物与CLAMS组动物在睡眠时间和觉醒次数和短时觉醒次数上均没有明显的差异。二、建立筛选共病睡眠障碍PTSD大鼠的方法SPS应激后第9日,与空白对照组比较,SPS暴露组大鼠睡眠时间没有明显变化,觉醒次数和短时觉醒次数明显增多(P<0.01和P<0.05);高反应组大鼠睡眠时间明显减少(P<0.05),觉醒次数和短时觉醒次数均明显增多(P<0.01)。SPS应激后第14日,SPS暴露组大鼠仅短时觉醒次数增多(P<0.05);高反应组大鼠觉醒次数和短时觉醒次数明显增多(P<0.05和P<0.01)。睡眠相关指标与新异环境中SPS大鼠僵直时间的相关性研究发现,SPS暴露组大鼠和高反应组大鼠睡眠时间、觉醒次数和短时觉醒次数均与大鼠在新异环境中僵直时间有相关性(P<0.05或P<0.01)。三、朱砂安神丸对PTSD大鼠睡眠的影响SPS应激后第9日,在明相,与对照组大鼠相比较,模型组大鼠各项睡眠指标均有显著性变化(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较,阳性药组和朱砂安神丸高、低剂量组大鼠睡眠各项指标均未有明显影响。在暗相,与空白对照组大鼠相比较,模型组大鼠短时觉醒次数显著升高(P<0.05)。与模型组比较,阳性药组和朱砂安神丸高、低剂量组大鼠短时觉醒次数均未有显著性变化。SPS应激后第14日,与对照组大鼠相比较,模型组大鼠觉醒次数和短时觉醒次数均有显著性差异(P<0.01)。与模型组比较,阳性药组和高剂量朱砂安神丸组大鼠觉醒次数和短时觉醒次数均显著降低(P<0.05或P<0.01);低剂量朱砂安神丸组大鼠短时觉醒次数显著减少(P<0.05)。在暗相,与对照组大鼠相比较,模型组大鼠短时觉醒次数显著增加(P<0.05)。与模型组比较,阳性药组和高剂量朱砂安神丸组大鼠短时觉醒次数均显著降低(P<0.05)。第三部分:基于LC-NA神经系统的朱砂安神丸改善PTSD大鼠恐惧消退障碍和睡眠障碍的神经生物学机制研究一、基于LC-NA神经系统的朱砂安神丸改善PTSD大鼠恐惧消退障碍的神经生物学机制研究与假操作组相比,模型组大鼠LC内TH和CRFR1二者的mRNA和蛋白表达明显增强(P<0.01和P<0.05),CeA内CRF mRNA和蛋白表达明显增强(P<0.01或P<0.05),PVN中仅mRNA表达明显增强(P<0.05)。与模型组比较阳性药哌唑嗪显著降低了 TH mRNA和蛋白表达(P<0.05 和 P<0.01),以及 CeA 内 CRF mRNA 表达(P<0.01);高剂量ZSASW明显降低TH mRNA和蛋白表达(P<0.01或P<0.05),只降低 CRFR1蛋白(P<0.05)和 CeA 内 CRF mRNA 表达(P<0.01);低剂量ZSASW明显降低CeA内CRF mRNA(P<0.01)表达。二、基于LC-NA神经系统的朱砂安神丸改善PTSD大鼠睡眠障碍的神经生物学机制研究对大鼠尿液中皮质酮水平研究发现与假操作组相比,模型组大鼠暗相尿液中的CORT水平显著升高(P<0.05);明相CORT变化不明显。与空白对照组相比,模型组大鼠LC内的TH mRNA和蛋白表达均明显增强(P<0.01),PVN内CRF mRNA和蛋白表达明显增强(P<0.05)。与模型组比较,阳性药哌唑嗪使LC内的TH mRNA和蛋白表达明显下降(P<0.05和P<0.01),同时PVN内CRF蛋白表达明显下降(P<0.05);高剂量ZSASW明显降低TH mRNA和蛋白表达(P<0.01),使PVN内CRF蛋白表达明显下降(P<0.05)。结论:1、朱砂安神丸可以增强恐惧消退记忆的保持,提高恐惧消退的效率。2、朱砂安神丸有改善PTSD大鼠睡眠障碍的作用。3、朱砂安神丸改善PTSD大鼠恐惧消退障碍的作用一方面是由于药物下调LC内的CRFR1水平,同时又减弱了 CeA内CRF mRNA表达,最终减弱了 CRF对LC的兴奋作用,从而下调了 LC-NA的神经功能,使恐惧表达(僵直)减少;另一方面,由于朱砂安神丸改善大鼠睡眠的作用,有利于消退记忆的巩固,改善了 PTSD大鼠的场景恐惧消退障碍。4、朱砂安神丸改善PTSD大鼠睡眠障碍的作用与下调LC-NA神经功能有关,而LC-NA的上游调节机制可能与药物降低了 PVN内CRF表达有关。