弓形虫病是由刚地弓形虫胞内寄生引起的原虫病,是一种全球传播性的人畜共患病,目前全世界范围内约有三分之一人口被弓形虫感染。极强的传播性和高感染率,使其对世界范围内的人类和畜牧业的健康与发展产生了严重负面影响。宿主自身应对弓形虫感染的相关防御机制较为复杂,其具体的免疫应答反应及相应防御清除措施并不完全清楚。通常认为,凋亡、自噬等程序性细胞死亡过程是宿主细胞应对细菌、寄生虫等病原体的重要防御应答方式。借助这一“自杀”过程,多细胞生物体内的先天免疫系统便可自主应对病原生物的感染,通过细胞程序性死亡,降解并清除宿主细胞内的细菌、寄生虫等病原体。然而,有研究发现细菌、寄生虫等病原体会干扰凋亡、自噬通路相关蛋白的识别聚集,影响自噬体、凋亡小体等的形成,进而抑制宿主细胞的降解破坏。因此,宿主细胞自主降解与病原体对宿主细胞自主死亡的抑制之间存在着竞争关系,这一竞争关系的强弱影响着宿主自身对病原体感染防御应答能力。而目前关于宿主细胞程序性死亡与弓形虫感染之间具体的竞争机制所知甚少。因此,对弓形虫感染以及宿主自身防御应答反应等相关机制的进一步探讨为有效地预防和治疗弓形虫病提供重要的理论基础。CCAAT/增强子结合蛋白β(C/EBPβ)是一种重要的转录因子,属于转录因子CCAAT/增强子结合蛋白(C/EBPs)家族成员。C/EBPβ蛋白具有高度同源性,在人、牛、猪、鼠等多个物种的各部位组织器官中几乎均有表达,通过对目标靶基因的转录进行调控,在细胞生长、分化、凋亡以及机体代谢、免疫应答等发面发挥作用。已有研究表明,C/EBPβ的异常表达与机体炎症、内质网应激等病理改变相关,并且参与人类疾病的发生过程。同时C/EBPβ也参与细胞自噬的调节。在正常生理条件下,C/EBPβ可调节相应细胞自噬过程以维持机体营养和代谢的平衡。而在病理条件下,C/EBPβ可介导自噬的发生进而影响机体对于病原体的防御应答反应,参与炎症、肝纤维化、癌症等病理事件的发生。那么,C/EBPβ在弓形虫感染的宿主体内是否发生表达水平的变化?是否参与宿主对弓形虫感染的防御应答过程?其分子机理是否与受感染宿主细胞的程序性死亡有关?这些问题的回答对于进一步理解弓形虫感染及其预防机制具有重要意义。基于上述推测,以弓形虫感染小鼠模型及细胞模型为对象,分析C/EBPβ在弓形虫感染小鼠0体内及体外细胞中的表达情况,研究C/EBPβ表达变化对弓形虫感染与宿主机体抗感染反应的影响,以及C/EBPβ是否对弓形虫感染宿主细胞凋亡、自噬过程存在作用。以此进一步分析C/EBPβ是否对p38 MAPK、m TOR等细胞凋亡、自噬过程相关信号通路具有调控作用,研究其可能分子机制,为深入理解宿主机体抗弓形虫感染的应答机制提供新的依据。第一部分弓形虫感染宿主细胞对C/EBPβ表达的影响1.弓形虫感染细胞C/EBPβ的表达情况通过RH株、ME49株弓形虫与脑微血管内皮细胞、脐静脉内皮细胞、视网膜色素上皮细胞共培养构建弓形虫感染细胞模型,以q RT-PCR、Western blot法,分别于弓形虫感染再培养24 h后,检测受感染细胞中C/EBPβ分子的表达水平。结果表明,与未感染对照相比,受感染细胞中C/EBPβm RNA及蛋白表达水平均升高,且ME49株感染C/EBPβ表达水平升高明显。2.弓形虫感染小鼠组织中C/EBPβ的表达情况通过ME49株弓形虫感染小鼠构建弓形虫感染小鼠模型,以正常小鼠组织为对照,采用q RT-PCR、Western blot法,分别于弓形虫感染后2d、4d、6d后检测模型小鼠腹腔液、脑组织、眼部组织中C/EBPβ表达水平;分析C/EBPβ分子的表达差异与弓形虫感染小鼠时间变化相关性。结果表明,与对照相比,弓形虫感染小鼠腹腔液、脑组织、眼部组织中C/EBPβ的m RNA及蛋白表达水平均显著升高,且其表达变化与弓形虫感染小鼠时间呈现出一定正相关性。第二部分C/EBPβ在小鼠抗弓形虫感染中的作用1.C/EBPβ表达变化对小鼠细胞中弓形虫感染的影响构建重组Ad-C/EBPβ腺病毒及C/EBPβsi RNA,过表达或抑制弓形虫感染模型细胞中C/EBPβ的表达水平,分析其对弓形虫感染及受感染细胞中弓形虫速殖子增殖的影响。结果表明,转染Ad-C/EBPβ腺病毒及C/EBPβsi RNA后,弓形虫感染细胞模型中C/EBPβ的表达水平被显著上调或抑制。弓形虫感染再培养24 h后,C/EBPβ过表达组受感染细胞的比例较对照组显著降低,同时细胞中弓形虫速殖子数目也较对照组明显减少;相反,与对照组相比,C/EBPβsi RNA组受感染细胞比例及细胞中弓形虫速殖子数目都明显增加。2.C/EBPβ表达变化对小鼠弓形虫感染的影响构建C/EBPβ特异性si RNA,以腹腔注射法使弓形虫感染小鼠模型体内的C/EBPβ表达受到抑制,通过体征观察与显微镜检等方法,观察C/EBPβ表达抑制后弓形虫感染小鼠模型的病症变化及腹腔液中假包囊、速殖子变化情况。结果表明,C/EBPβ特异性si RNA处理弓形虫感染小鼠模型后,小鼠腹腔液中C/EBPβ的表达水平显著抑制。与对照相比,弓形虫感染后,C/EBPβ沉默组小鼠表现竖毛症状加重、行动能力、精神状态、腹泻症状等均更加严重;腹腔液中假包囊破裂加剧,游离速殖子数目急剧增加,弓形虫感染小鼠的总体病症有加重趋势。第三部分C/EBPβ在抗弓形虫感染中细胞凋亡与自噬的作用过表达或抑制弓形虫感染细胞模型中C/EBPβ的表达水平,分析其对弓形虫感染细胞增殖、细胞周期进程、细胞凋亡、细胞自噬的影响;通过自噬抑制或诱导分析宿主细胞自噬对弓形虫感染及弓形虫速殖子增殖的影响。结果表明,与对照相比,过表达或抑制C/EBPβ对受感染细胞的增殖及细胞周期进程尚未有显著影响。而C/EBPβ过表达组受感染细胞的凋亡及自噬水平均明显增加。相反C/EBPβ抑制组受感染细胞的凋亡与自噬则显著降低。此外,C/EBPβ过表达对受感染细胞比例与弓形虫速殖子数目的降低作用被自噬抑制剂3-MA所影响,而在C/EBPβ抑制组中受感染细胞比例与弓形虫速殖子数目的增长作用则被自噬诱导剂雷帕霉素所抑制。第四部分C/EBPβ调控细胞凋亡与自噬相关信号通路在抗弓形虫感染中的机制过表达或抑制C/EBPβ表达后,检测弓形虫感染细胞模型中mTOR、ERK、p38 MAPK、JNK等信号分子的活化水平。以m TOR、p38 MAPK等信号通路抑制剂或激活剂处理细胞,检测上述信号通路在C/EBPβ介导的弓形虫感染的调控过程中发挥的作用。结果表明,与对照相比,C/EBPβ过表达组受感染细胞中p38MAPK磷酸化水平显著上调,m TOR磷酸化水平明显降低;而C/EBPβ抑制组细胞中p38 MAPK磷酸化水平显著下调,m TOR磷酸化水平明显升高;两组中ERK1/2、JNK磷酸化水平均无明显变化。此外,C/EBPβ过表达对受感染细胞比例与弓形虫速殖子数目的降低作用被m TOR抑制剂加强,被m TOR激活剂与p38MAPK抑制剂所抑制。综上所述,弓形虫感染发生后,宿主机体主要组织内C/EBPβ的表达水平逐渐上调,C/EBPβ表达的变化能引起宿主细胞内p38 MAPK信号通路的活化,同时抑制m TOR信号分子的磷酸化水平,两种信号通路的激活与抑制,对宿主细胞的凋亡及细胞自噬过程均有促进作用,上述过程与C/EBPβ介导的抗弓形虫作用有关。以上研究表明,C/EBPβ通过调控下游信号通路的变化,促进宿主细胞凋亡与自噬的发生,进而抑制弓形虫对宿主细胞的感染,加速弓形虫体的清除