糖缀合物在许多生理过程中发挥着不可或缺的作用,在食品工业,环境保护、洗涤剂工业和医药卫生等领域均有广泛应用,是非常重要的化合物。目前糖缀合物的获取方法主要是通过化学法和生物法合成,生物法中包括微生物发酵法和酶法,而酶法又占主要部分,糖苷酶在酶法合成糖缀合物中发挥重要作用。在本文中,我们使用一系列从嗜热细菌Thermotoga naphthophila RUK-10中克隆,在E.coli BL21(DE3)中表达的嗜热糖苷酶:β-葡萄糖苷酶TN0602、β-半乳糖苷酶TN1577、β-半乳糖苷酶TN0949、及TN0602的突变体,探究糖苷酶在合成不同糖缀合物,如低聚半乳糖、烷基糖苷和L-抗坏血酸半乳糖苷中的作用。低聚半乳糖作为一种益生元,其不能被人体的消化酶所消化,但可以被肠道中的益生菌所利用。目前,酶法合成低聚半乳糖大多是通过β-半乳糖苷酶以乳糖为底物通过转糖苷合成的,产物多是不同聚合度低聚半乳糖的混合物,而TN0602能够以极高的催化选择性合成低聚半乳三糖,因此该反应对单一成分低聚半乳糖的功效研究有重要作用。TN0602在p H 6.5和75°C下能以23.28 g L-1 h-1的生产率催化半乳三糖的合成,与来自米曲霉的β-半乳糖苷酶在反应动力学、酶-底物热力学结合和分子对接模拟等方面的比较研究表明,β-葡萄糖苷酶TN0602具有深且狭窄的催化口袋,可阻止乳糖和低聚半乳三糖同时进入催化位点。为了验证这一结果和降低TN0602的水解活性,我们对TN0602进行了定点突变研究,测定了突变对反应动力学、酶活性和产物组成方面的影响。结果表明,位于乳糖结合亚位点(-1)附近的414位苯丙氨酸突变为丝氨酸时,突变体通过抑制酶的水解活性增加了低聚半乳三糖的产量。不同突变体与低聚半乳三糖的分子对接结果证明了TN0602催化口袋的形状能够影响到转糖苷产物(低聚半乳糖)的组成。L-抗坏血酸是一种人体不能合成的必需营养素。由于L-抗坏血酸易降解,目前已经开发了各种L-抗坏血酸的衍生物以改善其稳定性;然而,通常合成L-抗坏血酸衍生物往往需要多步反应且产量较低。在本文中,我们开发了一种以乳糖为底物,以碳酸钠为酸碱调节剂,以TN0602为催化剂转糖苷合成L-抗坏血酸半乳糖苷的新方法。反应最佳温度和p H分别为75°C和5.0,最佳酶浓度和底物摩尔比分别为20 mg m L-1和2:1(L-抗坏血酸对乳糖)。在最优条件下,反应体系中L-抗坏血酸半乳糖苷最终浓度可达到138.88 m M。L-抗坏血酸半乳糖苷保留了L-抗坏血酸的抗氧化能力,其在氧化环境(Cu2+)中比L-抗坏血酸更稳定,因此L-抗坏血酸半乳糖苷在工业上有很大的应用潜力。烷基糖苷是一类温和、无毒、对皮肤无刺激,且易生物降解的天然表面活性剂。烷基糖苷的酶法合成主要在两相反应体系中进行,因此底物乳糖的溶解度成为制约反应速率和产率的瓶颈。本研究通过计算和筛选,发现了一种可用于TN1577催化转糖苷合成烷基半乳糖苷的离子液体——Ammoeng 102,其含有C18酰基和低聚乙二醇的四氨阳离子,能够提高辛基半乳糖苷产量2.37倍,在反应7小时后辛基半乳糖苷终浓度可达18.2 g L-1。本文在动力学研究和COSMO-RS预测中阐明了TN1577的嗜热性质。Ammoeng 102能够提高产量的主要因素有:增加底物的溶解度,抑制酶的水解活力,以及与酶的极好的生物相容性(允许TN1577最适催化温度达到95°C)。同时本研究也验证了Ammoeng 102体系的一般适用性,成功合成了正丁醇至正十四烷醇作为糖基受体,乳糖作为糖基供体的一系列烷基糖苷。许多酶促反应时间过长,降低了设备的利用效率、限制了产能;有很多报道指出,微波辐射可应用于不同的催化反应,能够大大缩短反应时间,然而,微波辐射会使酶快速失活,大多数酶催化反应不能在微波辐射下进行。本研究筛选出了一个在微波辐射下稳定的酶——TN1577,可用于烷基半乳糖苷的合成,实验发现通过微波辐射可大幅度缩短反应时间、提高烷基半乳糖苷反应的生产率、并能降低反应所需的酶量。我们系统研究了乳糖与正丁醇摩尔比(1:200-1:40),温度(65-85°C)和微波输出功率(80 W-800 W)对转糖苷产量的影响。在最佳条件下(即乳糖和正丁醇摩尔比为1:40,反应温度为75°C),仅3.5小时的反应时间就达到17.07 mg m L-1的产率。与传统加热方法相比,微波辅助法可提高生产率11倍。在反应动力学方面,微波辐射能显著增加TN1577的kcat值,但对Km值几乎没有影响。因此,微波辅助的转糖苷合成方法能够以较少的时间和较低的成本快速地生产烷基糖苷。此项工作不仅为工业生产L-抗坏血酸糖苷、烷基糖苷和高纯度低聚半乳糖提供了新选择,而且表明我们开发的嗜热糖苷酶在工业中具有巨大潜能,可以为糖缀合物的合成提供新的合成途径。