背景胃癌一直以来都是严重威胁全世界人类健康的恶性肿瘤之一,也是我国最常见的消化道恶性肿瘤,其发病率和死亡率常年居高不下。胃癌的预后较差,尤其以肿瘤发展至进展期为甚,且及早的诊断和治疗可明显的改善胃癌患者的预后,降低其死亡率。但多数胃癌早期患者没有明显的自觉症状,或仅仅表现为恶心、呕吐等无特异性的胃肠道症状,容易与胃炎、胃溃疡等相混淆,无法引起人们的重视,从而延误了病情,错失最佳的治疗时机。往往就诊时多数患者已经处于局部晚期或发生了远处转移,所以早期的诊断与治疗是改善胃癌患者预后的关键。目前,临床上诊断胃癌常用的影像学检查主要包括胃镜及上消化道造影等,但由于医生的诊断水平不尽相同,胃癌早期患者的检出率并不高,而且胃镜检查是一种有创的检查,会引起患者不适,其费用较高,因而在胃癌高危人群中不易普及。同时CEA、CA19-9、CA72-4等作为临床上常用的血清肿瘤标记物,因缺乏敏感性及特异性对于胃癌患者的早期诊断帮助并不大。在这样的背景下,临床上迫切需要找到新的与胃癌相关的具有高度敏感性和高度特异性的分子标记物,这也成为了胃癌相关研究的热点。蛋白质组学自提出后就得到了飞速的发展,其含义包括蛋白质和基因组两方面内容,可以理解为一种基因组转录表达的全套蛋白质。蛋白质组学的研究象征着生物学进入了后基因时代,其本质是以蛋白质组为研究对象,从整体的角度去分析细胞内动态变化的蛋白质组成及其活动的规律,在建立正常蛋白质表达指纹图谱的基础上,通过对正常人和患者(血清或瘤体)的蛋白质组进行比较分析,从而找到与某种疾病有关的特异性蛋白质。这些具有特异性的蛋白质不仅可以作为某种疾病早期诊断的蛋白标记物,而且也可为药物的研发提供新的分子靶点。进而对这些蛋白标记物的结构和功能进行研究,为疾病的发生发展提供病理生理学机制。蛋白质组学被认为是筛选特异性蛋白质标记物和药物分子靶点最有效的方法之一,随着相关技术不断的更新换代,为我们筛选和鉴定胃癌患者血清特异性标记物提供了技术平台,开辟了胃癌研究的新领域。本次实验主要依托表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术对胃癌患者血清(术前组、术后组、转移组)与正常对照组血清之间进行对比检测,筛选出胃癌患者血清中存在的特异性蛋白质或含量与正常人血清有差异的蛋白质。使用凝胶电泳(TRICINE-SDS-PAGE)技术对这些差异性蛋白质进行分离与纯化。通过基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF)技术对分离纯化的蛋白质进行鉴定,最终确定胃癌患者血清中具有特异性的蛋白标记物。后期研究其结构与功能,探索特异性蛋白质的表达与胃癌发生发展的关系,为胃癌的早期诊断及下一步的临床治疗提供了可能和依据。目的通过蛋白组学技术筛选并鉴定胃癌患者血清中可能存在的特异性蛋白标记物,为胃癌的早期诊断提供更为完善的血清蛋白质指纹图谱模型,为进一步研究胃癌的血清特异性蛋白标记物打下坚实的基础。材料与方法材料:本研究材料收集郑州大学第一附属医院普通外科自2013年5月至2014年1月前来就诊的60例首诊胃癌患者,其中男性患者46例,女性患者14例,年龄42~84岁,平均年龄58±0.5岁。其中20例就诊时已证实胃癌多发转移,未经手术治疗,采集血清标本设为转移组。余40例患者原发胃癌诊断明确,且无手术禁忌拟行手术治疗,于术前1天和术后第12天各采集血清标本一次,分别设为术前组和术后组。所有患者采集标本前均未接受化疗、放疗等治疗,经手术和病理诊断为胃腺癌,其组织病理分型均为中、低分化型腺癌。病理学诊断均经过两位以上的病理学专家的证实。所有60例患者的血样标本均自清晨空腹状态下抽取,血液抽取后将血样放置于干燥试管中于室温下静置1小时使血液自然凝固,而后在离心机中以3000 r/min的速度进行离心15min,抽取离心沉淀后的上清液移至PE管中,置入-80℃冰箱进行保存。本实验通过了本院伦理委员会的伦理审查,受试者均已签署知情同意书。方法:冰浴中解冻血清,4℃10000r/min离心2min。取96孔板置于冰盒上,每孔加入U9(9mol/L尿素),1%Bar,2%CHAPS10μL,血清和瘤体组织总蛋白样本5μL,4℃层析柜中600r/min振荡30min。在震荡结束前15 min做蛋白质芯片预处理,芯片装入加样器Bioprocessor中,标记下芯片号码,每孔加入Na AC(100mmol/L,p H4)200μL,层析柜中600r/min振荡2min,重复以上操作1次。经过U9处理后的96孔板置于冰盒上,用排枪加入Na AC185μL,层析柜中4℃600r/min震荡2min。取已处理的样本100μL加到蛋白质芯片上,置于层析柜中4℃600r/min结合60min,甩去残液,快速拍干。然后加入Na AC200μL,600r/min振荡5min后,甩去残液,快速拍干,重复3次。用200μL去离子水冲洗各孔2次,甩干。芯片风干后,每孔分两次加入50%饱和的SPA 1μL,干燥后上机待检测。用已知分子量的蛋白质芯片对SELDI-TOF-MS系统进行校正,使蛋白质分子量误差小于0.1%,然后将结合好蛋白质的WCX2蛋白质芯片用质谱分析仪进行分析。质谱分析的原始数据经过滤噪音和聚类分析处理后,对初步筛选出的质荷比峰值数据做Wilconxon秩和检验,检验标准取小于0.01。通过P值来判断同一m/z峰在各组之间表达的差异程度,P值越小提示这一m/z峰在两组之间越有统计学意义。结果1.胃癌术前组与正常组的比较结果胃癌术前组与正常组的质谱数据经过减掉基线、去噪及标准化处理,聚类分析得到各自的峰值,两组峰值经过Wilcoxon秩和检验,从而得到15个特异性m/z峰值(P<0.01)。其中在胃癌术前组低表达的为8个,高表达的7个。通过SVM筛选出youden指数最高的组合模型,得到m/z峰位于6449.1的蛋白标记物。在胃癌术前组呈高表达,表达强度为2299.3±2029.3。在正常患者组明显低表达,表达强度为509.5±168.3。两组比较差值具有统计学意义(P<0.01)。2.胃癌术后组与术前组的比较结果胃癌术后组与术前组的质谱数据经过处理和统计学分析后,得到P<0.01的特异性m/z峰6个,其中术后组中高表达为4个,低表达为2个。参考youden指数最高的组合模型,得到m/z峰位于6449.2的蛋白质标记物。在胃癌术前组呈高表达,表达强度为1247.9±685.0。在正常患者组明显低表达,表达强度为476.5±157.8。两组比较差值具有统计学意义(P<0.01)。3.胃癌术前组与转移组的比较结果胃癌术前组与转移组的质谱数据经过处理和统计学分析后,得到P<0.01的特异性m/z峰12个,其中转移组组中高表达为1个,低表达11个。参考youden指数最高的组合模型,得到蛋白质标记物m/z峰位于6448.9。在胃癌转移组的表达强度明显高于术前组,在胃癌转移组表达强度为1506.9±1036.5。在胃癌术前组表达强度为649.7±621.0。两组比较差值具有统计学意义(P<0.01)。4.特异性蛋白的鉴定通过MALDI-TOF/TOF平台对样本分离纯化及酶解后所得到的肽段混合物进行检测。m/z峰位于6449的蛋白质经过鉴定为Apo CⅢ(载脂蛋白CⅢ)。结论1.m/z峰位于6449的蛋白质经过鉴定为Apo CⅢ,考虑为胃癌的血清特异性蛋白标记物,为胃癌的早期诊断提供更为完善的血清蛋白质指纹图谱模型,对进一步研究胃癌的血清特异性蛋白标记物具有指导意义。2.m/z峰位于6449的蛋白质在胃癌中的表达程度与其肿瘤进展程度呈正相关,为后期研究特异性蛋白标记物与胃癌发生发展存在的关系提供了新的思路。