研究背景卵巢癌(ovarian cancer. OC)是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率高居妇科恶性肿瘤之首,晚期卵巢癌患者5年生存率仅约30%。尽管目前手术联合以铂类为基础的化疗的治疗方案已日臻成熟,但卵巢癌患者的生存率仍然比较低,其中一个重要的原因是大部分患者最终会出现化疗耐药而导致疾病复发。因此,深入认识卵巢癌的耐药机制,有效改善不良预后是卵巢癌临床治疗和基础研究的关键问题。研究表明,一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase, NOS)在多种肿瘤组织中普遍表达增强,可促进肿瘤的增殖、转移和化疗药物抵抗。人体有三种NOS(NOS1, NOS2和NOS3)。它们均通过氧化L-精氨酸合成一氧化氮(Nitric oxide, NO). NOS1和NOS3分泌较低浓度的NO,促进肿瘤生长和血管生成。而NOS2主要存在于肥大细胞、巨噬细胞及中性粒细胞,受到外界刺激后被激活,可产生高浓度的NO,诱导炎症相关反应,促进或影响肿瘤生长。低浓度NO促进肿瘤生长,而高浓度NO则抑制肿瘤生长。抑制肿瘤生长的浓度要比促进肿瘤生长时浓度高10-100倍。目前已有研究证实,不同的NOS亚型与结肠癌、乳腺癌、头颈部肿瘤等恶性肿瘤的化疗耐药表型有关。此外,NOS1产生的较低浓度的NO对肿瘤细胞具有保护性作用,抑制肿瘤细胞的凋亡,从而导致肿瘤耐受化疗药物,导致耐药乃至肿瘤复发。然而,目前关于NOS 1对卵巢癌化疗敏感性的影响及其调控机制尚未完全阐明。高表达ATP结合盒G超家族成员2(ATP-binding cassette superfamily G member 2, ABCG2)是介导多种恶性肿瘤细胞多药耐药(multi-drug resistance,MDR)的主要机制。ABCG2作为一种多次跨膜蛋白,可以利用ATP水解提供的能量主动的将肿瘤细胞中的化疗药物等外来物质泵出细胞外,导致恶性肿瘤细胞逃避化疗药物杀伤作用,是化疗失败的重要因素之一。ABCG2在多种肿瘤细胞中都报道其表达增强,包括食管癌、子宫内膜癌、鼻咽癌以及黑色素瘤等。卵巢癌细胞系中ABCG2+细胞对化疗药物长春新碱的耐受性高于ABCG2-细胞,而ABCG2抗体可增加ABCG2+细胞对长春新碱的敏感性。ABCG2与肺癌、食管癌、急性白血病等多种恶性肿瘤患者的预后相关。近年来有研究表明,ABCG2作为还原性物质谷胱甘肽(glutathione, GSH)的转运子,在细胞内氧化还原平衡中起着重要作用。此外,ABCG2可以限制叶绿酸-A以及卟啉类化合物的摄入,从而影响细胞内单态氧产生,导致DNA水解及细胞凋亡的发生。这些研究提示,ABCG2对恶性肿瘤化疗敏感性的影响除了其自身药物泵的生理功能起作用外,还有可能与细胞内的氧化还原平衡有关。有研究证实,NOS通过其产物NO促进抗氧化相关的转录因子HIF-la, Nrf2等的活性,上调抗氧化物质SOD、TrxRl的转录,进而增强肿瘤细胞对化疗后局部组织的缺氧环境的耐受能力,减少肿瘤细胞凋亡,促进耐药的发生发展。然而,对于NOS/NO相关的化疗耐药是否与经典的多药耐药基因ABCG2有关,两者之间潜在的机制如何,尚未见研究报道。我们通过实验发现,NOS1可以调控多药耐药基因ABCG2的表达,并且NOS1导致的卵巢癌化疗耐药部分依赖ABCG2的增强。我们进一步探索了NOS1调控ABCG2的可能机制,以期为逆转卵巢癌的铂类耐药、改善卵巢癌患者的预后提供更新更好的策略。研究目的卵巢癌死亡率居妇科恶性肿瘤之首。化疗耐药是其复发、转移乃至死亡的主要原因。本课题前期研究表明NOSs影响卵巢癌细胞的生物学功能,包括增殖、侵袭、迁移以及上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)功能。另外,通过芯片数据分析NOS在卵巢癌中表达增强,与卵巢化疗耐药相关。在此基础上,本课题从多药耐药相关基因ABCG2入手,探讨NOS影响卵巢癌顺铂耐药的可能机制。(一)NOS与卵巢癌ABCG2表达、化疗敏感性及预后的相关性研究方法1)根据Pubmed公共资源GEO数据库中卵巢癌组织的全基因表达谱数据进行相关性分析,讨论三种NOS亚型(NOS1, NOS2, NOS3)与ABCG2表达的相关性；2)利用Kalan-Meier法分析三种NOS亚型表达水平与卵巢癌患者生存时间的相关性,从而明确NOSs是否可能参与卵巢癌发生发展过程；3)利用铂类敏感性卵巢癌组织和耐药性卵巢癌组织表达谱芯片,分析三种NOS亚型以及ABCG2的表达水平与卵巢癌铂类敏感性的相关性。研究结果1)NOS1与ABCG2的表达存在正相关关系,且具有统计学意义(r=0.211,P<0.01)；NOS2与ABCG2的表达存在负相关关系,且具有统计学意义(r=-0.422, P<0.01); NOS3与ABCG2的表达存在正相关关系,且具有统计学意义(r=0.342,P<0.01)。提示NOS的三种亚型对多药耐药基因ABCG2的表达以及卵巢癌化疗耐药可能具有不同的作用；2)NOS1和ABCG2高表达的卵巢癌患者生存时间短、预后差, 其中NOS1和ABCG2相关显著性分别为P=0.0421和P=0.0237 (Log-rank Test),但NOS2、NOS3与生存的相关性无统计学意义；3)铂类耐药组卵巢癌组织中ABCG2的表达量显著高于铂类敏感组,差异有统计学意义(t=2.184, P<0.05); NOS1在铂类耐药组中的表达量高于铂类敏感组(t=1.189, P=0.245), NOS2在铂类耐药组中的表达量低于铂类敏感组(t=-0.836,P=0.411), NOS3在两组中的差异不明显(t=0.15,P=0.882)。研究结论1)三种NOS亚型与ABCG2有不同的相关关系,其中NOS1及NOS3与ABCG2均呈正相关关系,而NOS2与ABCG2呈负相关关系；2)NOS1与卵巢癌患者的生存时间相关,NOS2和NOS3与卵巢癌患者的生存时间无关；3) ABCG2与卵巢癌患者的生存时间相关；(二)NOS1对卵巢癌细胞顺铂敏感性的影响研究方法1)MTT实验检测卵巢癌细胞株OVCAR-3和SKOV-3对顺铂敏感性的差异；2)MTT实验检测NOS1过表达的GV375-NOS1 ov-3和对照组GV375-NCov-3细胞对顺铂的敏感性的差异；3)MTT实验检测干扰NOS1表达的SKOV-3细胞si-NOS1 SKOV-3以及对照细胞si-NC SKOV-3对顺铂敏感性的差异。4)预先使用顺铂联合NOS各型抑制剂以及NO供体处理OVCAR-3细胞,运用流式细胞仪Annexin V法检测细胞凋亡及细胞死亡。5) Western blot实验检测顺铂联合NOS抑制剂处理对于卵巢癌细胞株中ABCG2表达的影响。研究结果1)顺铂作用48小时后的人卵巢上皮性癌细胞株SKOV-3和OVCAR-3,半数抑制率(half maximal inhibitory concentration. IC50)之间的差异具有统计学意义(t=-4.358,P<0.05)；2)顺铂作用48小时后的人卵巢上皮性癌细胞株GV375-NOS1 ov-3和GV375-NC ov-3细胞,IC50之间的差异具有统计学意义(t=-25.739,P<0.01)；3)顺铂作用48小时后的人卵巢上皮性癌细胞株si-NOS1 SKOV-3和si-NC SKOV-3细胞,IC50之间的差异具有统计学意义(t=4.128,P<0.05)；4)顺铂可以提高卵巢癌细胞中ABCG2的表达量,NOS抑制剂可逆转ABCG2的表达增强；5)顺铂单独作用72小时或顺铂作用72小时联合NOS抑制剂或NO供体作用48小时后的OVCAR-3细胞之间的细胞凋亡率具有统计学意义(χ2=20.637,P<0.01)；6)顺铂单独作用72小时或顺铂作用72小时联合NOS抑制剂或NO供体作用48小时后的OVCAR-3细胞之间的细胞凋亡率具有统计学意义(χ2=17.098,P<0.01)。研究结论1)NOS1过表达增强了OVCAR-3对顺铂的耐药性；2)干扰NOS1的表达增强了SKOV-3对顺铂的敏感性；3) NOS1特异性抑制剂N-PLA联用顺铂相比于顺铂单药处理,增加了卵巢癌细胞的细胞凋亡及非凋亡性死亡率,N-PLA促进了顺铂对卵巢癌细胞的杀伤作用,从而提示抑制NOS1功能增加了卵巢癌的顺铂敏感性；4) 顺铂可以提高卵巢癌细胞中ABCG2的表达量,NOS泛抑制剂和NOS1抑制剂可逆转ABCG2的表达增强,提示NOS1可能通过调节ABCG2的表达调控卵巢癌细胞的顺铂敏感性。(三)NOS1通过上调ABCG2增强卵巢癌细胞对顺铂的耐药性研究方法1) qRT-PCR和Western Blot方法检测NOS泛抑制剂L-NAME对卵巢癌细胞中ABCG2基因表达的影响；2) Western Blot方法检测NOS几种不同的抑制剂对卵巢癌细胞中ABCG2基因表达的影响；3) Western Blot方法检测过表达NOS1的卵巢癌细胞及其对照细胞中ABCG2表达情况；4)免疫组化检测NOS1过表达对卵巢癌细胞裸鼠皮下移植瘤组织中ABCG2表达的影响。5)MTT实验检测ABCG2功能抑制剂维拉帕米对过表达NOS1的卵巢癌细胞株的顺铂敏感性的影响。研究结果1) L-NAME处理后48 h的OVCAR-3细胞和对照组细胞相比,ABCG2的mRNA表达差异具有统计学意义(P<0.01),ABCG2的蛋白表达水平明显降低；2)NOS2特异性抑制剂1400W处理后OVCAR-3细胞和对照组细胞相比,ABCG2的蛋白表达降低；NOS1特异性抑制剂N-PLA处理后ABCG2蛋白表达量明显降低;3)NOS1过表达的GV375-NOS1 ov-3和对照组GV375-NC ov-3细胞相比,NOS1的蛋白表达量明显高于对照组细胞,ABCG2基因的蛋白表达量明显高于对照组细胞；4)NOS1过表达的裸鼠皮下移植瘤和对照组裸鼠皮下移植瘤组织细胞中的ABCG2阳性率,差异有统计学意义(t=-15.697；P<0.01)。5)NOS1过表达增强卵巢癌细胞对顺铂的耐药性,抑制ABCG2的功能可逆转此现象。研究结论本章从基因水平验证NOS1可调控ABCG2的表达水平,卵巢癌细胞由于NOS1过表达而增加的顺铂耐药性,可以被ABCG2的功能抑制剂逆转。说明NOS1通过调节ABCG2调控卵巢癌的顺铂敏感性。