RNA 5-甲基胞嘧啶是信使RNA上相对丰度较高的一种修饰,然而长期以来该修饰的研究主要集中在转运RNA和核糖体RNA上,近年来随着测序技术和质谱技术的发展进步,RNA 5-甲基胞嘧啶修饰在信使RNA上作用的神秘面纱逐渐被揭开。伴随着RNA 5-甲基胞嘧啶修饰高分辨率单碱基图谱的绘制,人们发现了RNA 5-甲基胞嘧啶修饰在信使RNA上的分布规律以及参与修饰调控的相关蛋白质,包括甲基化酶、去甲基化酶以及识别蛋白。目前被报道的主要识别蛋白为Aly/REF Export Factor（ALYREF）。ALYREF主要位于细胞核内,而细胞质基质中信使RNA上的RNA 5-甲基胞嘧啶修饰是否有其他的识别蛋白尚未可知。寻找和鉴定新的RNA 5-甲基胞嘧啶修饰的结合蛋白将有助于推动深入地研究RNA 5-甲基胞嘧啶修饰的生理功能。本研究前期通过文献调研锁定了一个人源蛋白Y-box binding protein 1（YBX1）,属于RNA结合蛋白Y-box家族,能够通过保守的cold shock domain（CSD结构域）结合RNA。体外结合实验验证了YBX1结合RNA 5-甲基胞嘧啶修饰的能力,且对于RNA 5-甲基胞嘧啶修饰比非甲基化修饰的RNA具有更高的亲和力。进一步通过解析YBX1与RNA 5-甲基胞嘧啶修饰和非甲基化修饰RNA复合物的晶体结构,揭示了YBX1对RNA 5-甲基胞嘧啶修饰具有更高亲和力的分子基础,并获得了参与结合甲基化修饰位点的关键氨基酸信息。本研究针对结合位点W65、F74、F85、H87以及K118进行了定点突变,随后利用ITC进行滴定实验,实验结果显示,W65、F74、F85、H87的突变导致YBX1无法与RNA结合,说明疏水相互作用对于YBX1与RNA的结合非常重要,而K118的突变导致亲和力下降4倍,则表明K118对YBX1与RNA 5-甲基胞嘧啶修饰的亲和力提高起到重要影响。与此同时合作利用模式生物黑腹果蝇,探索了YBX1的同源蛋白Ypsilon Schachtel（YPS）在体内的生理功能。在YPS缺失的黑腹果蝇生殖腺中回补表达人源的同源蛋白YBX1,发现YBX1可以替代YPS从而使得黑腹果蝇生殖干细胞得以正常发育,证明两个同源蛋白在功能上具有保守性。同时通过Flag标签下拉和免疫共沉淀实验表明YPS能在体内结合带有RNA 5-甲基胞嘧啶修饰的信使RNA。对比YBX1结合RNA 5-甲基胞嘧啶修饰的关键氨基酸,发现这些位点在黑腹果蝇的YPS中完全保守。不能结合RNA 5-甲基胞嘧啶修饰的黑腹果蝇突变体表现为显性失活,会打乱黑腹果蝇生殖干细胞的发育。综上所述,本研究鉴定和发现了一个新的RNA 5-甲基胞嘧啶修饰的结合蛋白,为研究RNA 5-甲基胞嘧啶修饰的功能提供了有力的分子工具。通过对YBX1与RNA 5-甲基胞嘧啶修饰复合物的结构解析,揭示了YBX1识别表观遗传学修饰的具体机制,也探索了RNA 5-甲基胞嘧啶修饰潜在影响生殖干细胞发育的分子机制。此外,由于YBX1在多种癌症中均存在过表达的现象,本研究的发现对于未来抗癌药物的研发也提供了新思路。同时,开发新型针对信使RNA的基因编辑技术也是未来的探讨方向。