光学远场显微镜可以对活体样本进行非侵入成像,揭示生命活动的物质基础和基本现象,但其有限的空间分辨率,制约了在生物医学上的应用。超分辨荧光显微技术,自2014年获得诺贝尔化学奖后,基于相应物理理论和化学方法提升空间分辨率的手段已获得了长足的进步,不同显微仪器成功落地并成为生命科学领域重要的观测工具。但是,超分辨显微技术通常需要牺牲时间分辨率和增加光毒性,以换取空间分辨率的提升,而对于活细胞成像这样高度动态和敏感的应用,目前的方法则可能影响生命体的本征状态。本论文旨在从数学计算的角度,优化超分辨显微成像重建方法,扩展信息提取能力,在不牺牲时间分辨率和低光毒性的前提下,实现空间分辨率的提升。同时,建立在相应超分辨尺度上对重建图像的定量化评估手段。相应的研究成果解决了活细胞超分辨显微成像领域的一系列难题,能够在现有硬件设置不变的前提下,获得更高的空间分辨率与图像质量可解释性。本文的主要研究内容如下:第一,针对传统解卷积超分辨技术对高频信息扩展能力有限和噪声敏感的问题,推导荧光成像的前向模型,提出“荧光显微图像的分辨率提高等价于图像的相对稀疏性增加”这一稀疏性约束条件,实现高频信息扩展;基于奈奎斯特采样定理,提出“在系统点扩散函数尺度内的图像强度应有连续性”这一连续性约束条件,抑制高频伪影。并将二者结合,提出基于稀疏性与连续性的联合约束解卷积重建方法,在稀疏性约束扩展信号高频信息的同时,连续性约束抑制噪声放大作用。利用不同结构样本仿真与交叉模态验证,表明联合约束解卷积能够稳定的在原成像系统基础上,进一步提升近2倍的空间分辨率。第二,在线性干涉结构光超分辨显微系统中,结构照明受限于衍射极限,空间分辨率只能提升至衍射极限的2倍左右。针对这一问题,提出基于联合约束解卷积模型的线性干涉结构光显微成像方法（Sparse-SIM）,在不改变原有光学设置的条件下,通过联合约束解卷积进一步提升空间分辨率,且保证不牺牲时间分辨率。利用特殊设计的DNA折纸与商业标准分辨率板,验证和标定了其空间分辨率从约120nm提升至约60nm。利用不同信噪比的实验,标定该系统的适用信噪比范围,在一般成像信噪比的1/4条件下仍能达到60nm分辨率。第三,计算超分辨技术的有效空间分辨率,与其具体实验设置和环境高度相关,超分辨重建图像的原位评估需要相应模型且依赖参考标准结构与图像,目前缺少一种不需要参考标准结构与图像的原位评估方法。针对这一问题,提出基于滚动傅里叶环相关的图像量化评价方法,直接对超分辨图像重建的不确定性进行显著性表征,在超分辨尺度上定量化原位评估相应图像重建质量,结合分辨率缩放误差图综合得到最终量化结果。利用该方法对解卷积、结构光、与单分子定位显微成像结果的成像质量,在超分辨尺度做定量化分析。并基于得到的精细误差量化评价,进一步优化计算超分辨技术,得到与真值更接近的成像结果。最后,研发的基于联合约束解卷积模型的线性干涉结构光显微镜能够在564Hz成像速率下达到60nm的横向分辨率,允许生物学家解析复杂的结构中间体及其快速的动态过程。选择具有代表性的活细胞实验来验证提出的超分辨活细胞成像技术的有效性和性能优势。例如,观察胰岛素细胞的囊泡超快分泌过程,新观察和总结到有两种特征的融合孔道存在,此外还包括活细胞内由不同核孔蛋白形成的环状核孔,网状的肌动蛋白,小球状的小窝蛋白、溶酶体和脂滴,小泡状的融合孔道,以及线粒体内外膜的相对运动等,充分验证研发的超分辨方法能够助力细胞代谢与分泌过程的高精度表征。