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背景:20世纪80年代以来,国内外陆续报道了600多例的"左旋咪唑引起脑炎综合征(急性脱髓鞘白质脑病)".多个项目的药物流行病学研究证实左旋咪唑(levami sole,LMS)与原因未明脱髓鞘性白质脑病存在因果关系.实验研究也证实LMS对中枢炎性脱髓鞘脑病的动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)有明显的促发加重作用.
目的：观察LMS不同阶段给药对Wistar大鼠EAE发病的影响及对其脊髓炎症相关细胞因子表达的影响,探讨LMS促发加重EAE的可能机制.
方法：Wistar大鼠四肢足垫皮下注射豚鼠脊髓匀浆(guinea pig spinal cordhomogenate,GPSCH)和完全弗氏佐剂(complete FreudS adjuvant,CFA)制成的乳剂,免疫诱导EAE模型.将雌性Wistar大鼠45只,随机分成五组:CFA对照组(8只)、EAE模型组(8只)、LMS免疫前给药组(LMS 1组,10只)、LMS免疫同时给药组(LMS 2组,9只)、LMS免疫后间断给药组(LMS 3组,10只).LMS 1组、LMS 2组、LMS 3组的大鼠分别在GPSCH-CFA免疫前、免疫同时、免疫后腹腔注LMS 10mg·kg<-1>.GPSCH-CFA免疫当日定为第0天,每同两次观察并记录动物行为学及体重的变化.采用量化评分法,比较LMS不同阶段给药对EAE发病率、潜伏期、症状评分及病理组织学评分的影响;免疫组织化学法测中枢神经系统(central nervous system,CNS)星形胶质细胞的胶质纤维酸性蛋白(glialfibrillary acidiC protein,GFAP)表达,并进行定量分析;同时用逆转录-聚合酶链反应(reverse transcriptase polymerase chain reaction,RT-PCR)法测大鼠脊髓干扰素-γ(interferon-Y,IFN-Y)、白介素-12/23 P40(inter]eukin-12/23 P40,IL-12/23 P40)、白介素-10(interleukin-10,IL-10)和转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)mRNA的表达,并将各细胞因子mRNA的表达水平与临床症状评分作相关性分析.
结果：(1)行为学观察:大鼠于免疫后11天开始陆续发病,EAE组发病率3/8(37.5﹪),潜伏期13.67±1.15天;LMSl组发病率5/10(50.0﹪),潜伏期14.40±2.07天,与EAE组比较无统计学差异;LMS2组发病率8/9(88.9﹪),潜伏期14.00±1.19天,发病率较EAE组高(P<0.05).病情严重程度相比,LMSl组和LMS2组较EAE组重:LMSl组的最大症状评分平均值(3.80±0.45)较EAE组(2.00±1.00)高(P<0.01),LMS2组的最大症状评分平均值(2.50±0.76)较EAE组略高,但统计学上差异无显著性;免疫后14天症状评分平均值比较,LMSl组(2.50±0.71)和LMS2组(2.00±0.00)均较EAE组(1.00±0.00)高(P<0.01,P<0.05).LMS1组和LMS2组的达最大症状时间(2.40±0.54天,2.00±0.53天)较EAE组(3.67±0.57天)短,提示LMS1组和LMS2组病情进展快.LMS3组首次发病率为2/10(20.0﹪),发病潜伏期、达峰时间、最大症状评分与EAE组比均无显著性差异;发病的2只大鼠症状持续5-6天即完全缓解,并分别在免疫后第23、25天相继再次出现后肢无力、瘫痪等EAE症状,但是持续时间较短,2-3天即恢复.(2)病理学变化:HE染色见发病大鼠CNS有大量炎性细胞浸润,以淋巴细胞为主,分布以脑干和腰髓居多,主要表现为血管套形成,噬神经现象、胶质细胞结节等.LMS1组和LMS2组炎症浸润较EAE组重(P<0.05),LMS3组的炎症浸润程度与EAE组差不多.Kluver&Barrera髓鞘染色见发病大鼠CNS内有大小不等的片状髓鞘脱失,大多局限在炎症改变明显的血管套周围的白质区.CFA对照组大鼠CNS未见异常病理表现.(3)星形胶质细胞GFAP的免疫组化结果:CFA对照组CNS仅有少量细小突起着色的星形胶质细胞:而EAE组CNS的GFAP阳性细胞数目比CFA对照组明显增加(P<0.01).与EAE组比,LMS1组及LMS2组CNS的GFAP阳性细胞染色数目和染色强度均进一步增加(P<0.01);LMS3组与EAE组比无明显差异.(4)RT-PCR结果:与EAE组比,LMS1组脊髓IFN-γ和IL-12/23 P40 mRNA表达升高,TGF-β1和IL-10 mRNA表达下降,但仅IL-10有统计学意义(P<0.01);LMS2组脊髓IFN-γ和IL-12/23 P40 mRNA表达升高(P<0.05,P<0.01),TGF-β1和IL-10 mRNA表达下降(P<0.05,P<0.01);LMS3组除IL-12/23 P40 mRNA有显著升高(P<0.01)外,其他无显著差异;CFA对照组脊髓细胞因子表达水平都很低(P<0.01).相关性分析结果显示,脊髓IFN-γ和IL-12/23 P40 mRNA表达水平与临床症状评分呈正相关,脊髓TGF-β1和IL-10 mRNA表达水平与临床症状评分呈负相关.
结论：(1)左旋咪唑免疫前给药能加重Wistar大鼠EAE的临床症状,加速病情进展,并能加重其中枢神经系统炎症细胞浸润和髓鞘脱失;(2)左旋咪唑免疫同时给药能使Wistar大鼠EAE发病率增加,临床症状加重,病情进展加速,并能加重其中枢神经系统炎症细胞浸润和髓鞘脱失:(3)左旋咪唑免疫后间断给药能促使Wistar大鼠EAE复发:(4)EAE病情的轻重与Th1类细胞因子的表达呈正相关,与Th2/Th3类细胞因子的表达呈负相关;(5)左旋咪唑能促进中枢神经系统Th1类细胞因子IFN-γ和IL-12/23 P40 mRNA的表达,抑制Th2/Th3类细胞因子TGF-β1和IL-10 mRNA的表达,导致Th1/Th2Th3平衡失调从而促发EAE;(6)左旋咪唑在促发EAE的过程中同时激活了星形胶质细胞.