缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury, IRI）的概念由Jennings于1960年首次提出，指缺血的组织器官重新获得血液供应后，组织、器官功能并没有得以恢复，其功能代谢障碍及组织结构破坏程度反而加重的现象。缺血再灌注损伤是常见的临床病理现象，涉及机体创伤与失血性休克、心脏冠状动脉缺血、心脏体外循环手术、肝脏部分切除术以及肝、肾脏等器官移植手术等，可严重影响疾病的预后，但由于对IRI发生的分子机制仍然缺乏深刻的了解，限制了临床防治方法的有效实施。特别是肝、肾、心脏等脏器移植过程中器官的获取和移植过程中产生的IR损伤可导致移植物无功能或功能延迟恢复，并增加移植物急、慢性排斥的发生率，影响移植物的中远期存活率，因此，如何有效的减轻IR损伤，以及更好的保护供体器官，都是亟待解决的研究课题。IR损伤的机制复杂，分为缺血、再灌注二个过程；缺血过程中由于缺氧后线粒体功能受损及ATP耗竭，造成能量代谢障碍、钙超载以及细胞凋亡等为主的损伤；再灌注后主要涉及到氧自由基释放造成蛋白和核酸的损伤，介导炎症反应及凋亡损伤的进一步加重。近年来，随着天然免疫产生机制的认识，模式识别受体（Patternrecognition receptors, PRRs）对病原体相关分子模式（pathogen associated molecularpattern,PAMP）识别机制也适用于对损伤相关的分子模式（DMAP: damge associatedmolecule pattern）的识别,从而认识到在肝脏IR过程中，缺血缺氧所致的直接损伤使受损细胞释放内源性配体或危险信号（HMGB-1、HSP、尿酸、纤维蛋白原等），激活肝细胞或非实质细胞表面的模式识别受体，从而启动天然免疫反应，介导进一步的损伤。由此可见，模式识别受体及其信号通路在肝脏IR的过程中发挥着关键的作用。然而，前期研究均集中在Toll样受体（Toll like receptors, TLRs）和相关的信号通路，而另一种重要的模式识别受体：RLRs （Retinoic-acid-inducible gene Ⅰ（RIG-Ⅰ）-likereceptors, RLRs）是否在肝脏IR损伤过程中也发挥作用并未受到关注。研究表明，RLRs所介导的抗病毒反应在机体抵抗病毒感染的天然免疫过程中发挥了关键的作用，其中又以维甲酸诱导基因Ⅰ（Retinoic-acid-inducible gene Ⅰ, RIG-Ⅰ）为最具代表性的分子，其是否在肝脏IR损伤过程中发挥作用以及如何发挥作用的机制值得探究。RIG-Ⅰ又称DDX58A，包含925个氨基酸残基，属于DExD/H家族，主要分布在胞质中。RIG-Ⅰ主要识别并直接结合5’端磷酸化的病毒RNA，与其受体MAVS（mitochondrial antiviral signaling protein）、IPS-1（IFN-βpromoter stimulator1）或Cardif（CARD adaptor inducing IFN-β）结合，通过活化NF-κB和IRF3/7，引起I型干扰素分泌上调，介导抗病毒免疫应答。然而，机体自身表达的RNA最初也有5’端的磷酸化修饰，尽管在正常情况下机体自身来源的RNA均不会在胞浆中激活RIG-Ⅰ信号。但是，当细胞坏死释放核内物质的时候，其中是否包括RIG-Ⅰ的配体？RIG-Ⅰ信号通路是否也如同TLRs一样参与肝脏IR的介导？目前尚无相关的研究报道。基于此，我们在本课题中研究了RIG-Ⅰ与肝脏IR之间的相互关系及其对肝脏IR损伤调控的相关机制。一、肝脏IR对RIG-Ⅰ表达的影响及可能机制为了探讨肝脏IR对RIG-Ⅰ表达的影响，我们采用小鼠部分肝脏IR模型（70%），观察IR后小鼠肝脏内RIG-Ⅰ的表达。小鼠缺血60min后，取再灌注（血流开放）后不同时间点的肝脏组织，western-blot检测IR后RIG-Ⅰ蛋白表达情况。结果显示IR之后，肝组织RIG-Ⅰ的表达出现短时间的降低，随着再灌注时间的延长，RIG-Ⅰ表达逐渐升高，免疫组化结果也证实IR后24h肝组织中炎症细胞浸润的细胞核周围可见RIG-Ⅰ蛋白DAB染色增多。随后，我们进一步分析了RIG-Ⅰ表达变化主要发生在何种细胞。我们在IR后不同时间，采用两步法分离出小鼠的肝细胞和非实质细胞，分别对其RIG-Ⅰ的表达情况进行了分析。结果表明，肝脏IR后RIG-Ⅰ在肝细胞中有表达变化显著，在非实质细胞中无明显变化，提示肝脏IR主要影响肝脏实质细胞的RIG-Ⅰ表达。我们再进一步探讨了肝脏IR影响RIG-Ⅰ表达的机制。由于RIG-Ⅰ上调的原因较多，可以由IR后期产生的各种炎性细胞因子介导，我们主要关注在IR早期的RIG-Ⅰ下调现象。我们首先分析了IR过程中必然存在的氧化应激在其中的作用，采用体外H₂O₂刺激新鲜分离的肝细胞、非实质细胞，发现H₂O₂呈剂量和时间依赖性下调肝细胞中RIG-Ⅰ表达，而对非实质RIG-Ⅰ表达基本无作用，证实在肝脏IR后早期是氧化应激作为诱因对肝脏实质细胞进行调控。根据RIG-Ⅰ蛋白表达下调的时间动力学特性，我们推测可能与现存蛋白的降解增加有关。因此，我们采用蛋白酶体抑制剂MG132预处理新鲜分离出的肝细胞，之后再进行H₂O₂刺激，发现IR后RIG-Ⅰ的下调得到抑制，提示肝脏IR后RIG-Ⅰ下调的直接机制可能与泛素蛋白酶体通路活化所致的蛋白降解有关。二、 RIG-Ⅰ在肝脏IR损伤中的作用肝脏IR后RIG-Ⅰ表达的变化提示RIG-Ⅰ可能参与肝脏IR这一病理生理过程。在本部分实验中，我们采用了RIG-Ⅰ缺陷的小鼠来探讨RIG-Ⅰ信号通路在肝脏IR中的具体作用。首先生化分析结果显示RIG-Ⅰ缺陷小鼠在肝脏IR后肝功能指标（转氨酶水平）升高幅度显著低于同窝对照的野生型小鼠，提示RIG-Ⅰ缺陷能明显减轻肝脏IR损伤。肝组织病理分析显示，同窝对照的野生型小鼠在IR后24小时肝细胞大量凋亡，坏死区域明显，而RIG-Ⅰ缺陷小鼠病理损伤程度明显降低，suzuki’s病理评分也进一步证实了这一结果。随后，我们研究了RIG-Ⅰ缺陷之后的这种损伤减轻与炎症反应的关系，采用免疫组化检测巨噬细胞（F4/80）的浸润，结果显示在RIG-Ⅰ缺陷小鼠巨噬细胞浸润程度明显降低，而进一步的结果表明其肝脏IR后炎症因子的产生均较野生型小鼠显著减低。凋亡与IR之间的关系密不可分，采用TUNEL法检测肝组织凋亡，我们发现与同窝野生型小鼠组相比， RIG-Ⅰ缺陷也能明显减轻肝细胞的凋亡，这就为RIG-Ⅰ缺陷小鼠病理损伤程度较轻进一步提供了证据。我们进一步通过构建骨髓嵌合小鼠以确定实质细胞还是非实质细胞来源的RIG-Ⅰ在肝脏IR中发挥作用，通过检测嵌合小鼠IR后转氨酶的水平发现实质细胞缺陷RIG-Ⅰ和非实质细胞缺陷RIG-Ⅰ小鼠的肝功能无明显差异，但都低于野生型小鼠，说明实质和非实质细胞的RIG-Ⅰ都参与介导肝脏IR损伤，但由于肝脏实质细胞占据肝脏细胞的绝大多数，且肝细胞的RIG-Ⅰ表达可以受IR调控，因此，在接下来的研究中，我们重点关注肝细胞的RIG-Ⅰ信号通路如何参与肝脏IR的进程。三、肝细胞RIG-Ⅰ信号通路通过促凋亡途径而致肝脏IR损伤RIG-Ⅰ作为RLRs家族的重要成员，其所介导抗病毒反应在机体抵抗病毒感染的天然免疫过程中发挥了举足轻重的作用。RIG-Ⅰ信号通路的活化不仅能够促进干扰素的产生，也能启动干扰素产生非依赖的促凋亡信号。已有报道表明在人的黑色素瘤细胞中，RIG-Ⅰ信号的触发可导致黑色素瘤细胞凋亡，但RIG-Ⅰ信号通路是否也参与介导肝脏IR后的凋亡，目前尚无相关的报道。鉴于凋亡是肝脏IR致损伤的关键机制之一，我们假设，RIG-Ⅰ信号通路增强肝脏IR所致的损伤可能与通过促进肝脏IR诱导的凋亡有关。首先，我们采用western blot检测了RIG-Ⅰ缺陷及野生小鼠在肝脏IR后早期caspase3、caspase8的活化情况，结果显示，IR后RIG-Ⅰ缺陷小鼠肝组织中上述凋亡相关酶的活化显著降低，提示RIG-Ⅰ信号通路与肝脏IR后的凋亡过程相关。我们进一步采用免疫共沉淀的方法证明了RIG-Ⅰ与caspase8二者存在直接的相互作用。为进一步研究在IR过程中肝细胞的RIG-Ⅰ是如何得到活化，我们进行了以下实验：将IR后的肝组织匀浆作为刺激物，分别对新鲜分离出的野生和RIG-Ⅰ缺陷的肝细胞刺激，通过RT-PCR检测IFN-β的表达、western blot检测IRF3的磷酸化水平，以及测定肝细胞凋亡情况等手段，检测匀浆刺激对RIG-Ⅰ信号通路的活化情况。结果显示：在野生肝细胞，IR后的肝组织匀浆可以促进IFN-β的产生，同时也介导凋亡，而在RIG-Ⅰ缺陷肝细胞，上述过程受到显著的抑制。由此我们认为IR后的肝组织匀浆具有激活RIG-Ⅰ信号通路的作用。我们在第二部分研究中已经发现，IR后的肝组织匀浆中含有明显升高的TNF-α、IL-6等细胞因子，这些细胞因子对RIG-Ⅰ信号通路可能存在一定的调节作用。此外，肝组织匀浆的制备过程中也必定会混入正常细胞的胞内物质，可能对结果产生影响。因此，我们借鉴文献方法，制备了肝细胞以及非实质细胞的坏死上清，作为条件培养基与新鲜分离的野生和RIG-Ⅰ-/-的肝细胞共孵育，并通过流式检测受刺激后肝细胞的凋亡情况。结果提示肝细胞和非实质细胞中存在可以激活RIG-Ⅰ信号通路的物质。为了进一步明确激活RIG-Ⅰ信号的配体，我们检测了坏死上清内的成分，结果发现ROS含量在肝细胞和非实质细胞的坏死上清中均较高，炎症因子TNF-α和IL-1β的蛋白表达水平在坏死上清中无明显改变，IL-6的蛋白水平在肝细胞坏死上清中轻度升高。随后，我们采用H₂O₂作为ROS直接刺激新鲜分离的野生及RIG-Ⅰ-/-的肝细胞，并检测刺激后IFN-β的表达变化，结果发现RIG-Ⅰ缺陷并未引起IFN-β的表达改变，提示ROS本身并不能激活RIG-Ⅰ信号通路。因此，我们推测可能是IR后受损的肝细胞或非实质细胞所释放的内源性危险信号，包括RNA等物质，激活肝细胞RIG-Ⅰ信号通路，进而通过促凋亡途径而导致肝脏IR损伤。结合上述三部分的研究，我们得出结论，RIG-Ⅰ对肝脏IR后的损伤效应呈正相促进作用。肝脏IR后早期因氧化应激导致RIG-Ⅰ表达下调，其直接原因是泛素蛋白酶体的活化而使RIG-Ⅰ降解，这种下调可能是机体应对损伤的自身防御机制。肝脏IR后受损的肝细胞/非实质细胞所产生的内源性危险素激活未受损肝细胞内的RIG-Ⅰ信号，通过炎症因子的放大效应以及与caspase8直接结合的的凋亡机制，介导IR后的肝脏次级损伤。本课题的研究结果首次阐述了维甲酸诱导基因I（RIG-Ⅰ）在肝脏IR损伤中的调控新机制，为肝脏IR损伤的防治提供了新的靶点，具有重要的理论意义和潜在应用价值。