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论文第一部分为钙调素(CaM)与膜受体p75NTR和Fas结合作用及复合物晶体结构研究。钙离子一直是信号传导系统的中心话题。CaM是钙离子的主要传导器,调控着300多种蛋白的生物功能。本论文选取了分别与人类神经系统疾病和癌症关系密切的2个膜受体,神经营养因子受体p75NTR和死亡受体Fas作为研究对象,分析它们与CaM间的相互作用。我们利用CaM Pull-down和BIAcore实验首次发现p75NTR是一个新的CaM结合蛋白,并且测定了CaM与p75NTR死亡结构域的结合动力学常数。然后通过分子筛洗脱峰位置分析、凝胶迁移率变动分析和BIAcore实验测定p75NTR上CaM结合靶点,确认了该靶点是死亡结构域的第5段α-螺旋,并解析了Ca2+-CaM/p75NTR肽复合物2.65(A)的晶体结构。该结构揭示了一种新型的CaM结合方式:“1-11”锚定模式。p75NTR肽还含有一段独特的由连续6个疏水残基构成的“中央疏水核”,而碱性残基簇的位置不能决定p75NTR肽的结合方向。在CaM结合蛋白Fas的研究中我们把CaM靶点精确定位在死亡结构域的第1段α-螺旋,并且解析了Ca2+-CaM/Fas肽复合物2.4(A)的晶体结构。Fas肽不含CaM靶肽中普遍存在的碱性残基簇,其末端Tyr残基所造成的空间位阻是决定Fas肽结合方向的因素之一。上述结构均是首次解析的p75NTR或Fas胞内片段与相互作用蛋白复合物的晶体结构,实验结果有助于人们深入了解p75NTR和Fas发挥作用的分子机制,并对CaM的靶蛋白识别方式有了新的认识。
论文第二部分为人吡哆醛激酶(HPLK)的晶体结构研究。吡哆醛激酶(PLK)催化依赖ATP的维生素B6的磷酸化反应,使之转变为磷酸吡哆醛。磷酸吡哆醛在生物体内是一种非常重要的酶辅助因子。我们利用大肠杆菌表达HPLK,并解析了其2.8(A)的晶体结构。经X射线衍射实验后发现,HPLK晶体存在完美的半晶面孪晶现象。结构精化时我们利用CNS程序去孪晶化并获得较好的结果。与天然羊脑PLK的晶体结构比较后发现,一段在活性位点处起关键作用的12个残基肽段在羊脑PLK中呈现“loop”状态,而在HPLK中呈现β-折叠/loop/β-折叠“flap”的构象,并且HPLK比羊脑PLK拥有更加疏水的ATP结合口袋,这可能是它们与ATP结合能力存在差异的原因。该晶体结构的解析将有助于人们对HPLK生化性质的深入了解并开展以结构为基础的相关药物设计。