巨噬细胞是一类分布广泛的吞噬细胞,由血液循环系统中的单核细胞迁移至组织处分化而来,是固有免疫的重要组成成员。巨噬细胞上表达多种Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs),能识别来自不同病原微生物上的病原体相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),并能迅速有效得做出反应,清除病原体,参与机体抵抗感染的第一道防线。同时,清除病原体的过程又不可避免会伴随炎症反应。而巨噬细胞是最先与病原体发生接触的细胞之一,因此,巨噬细胞又是一类非常重要的炎症细胞,能够介导并促进炎症反应,其过度活化会引起炎症的调控失衡,使生理性炎症反应转变为病理性的免疫损伤,从而导致多种炎症性疾病,如脓毒症。在巨噬细胞表达的多种TLRs,以TLR4介导的巨噬细胞炎性活化研究最为广泛,有多种针对TLR4的脓毒症药物都用于临床实验,但都因效果不佳或副作用太大而被撤销。因此,研究的目光开始转向到位于内体的TLR3上。TLR3是一种核酸感受器,它可以识别来自病毒或宿主细胞的双链RNA(Double-strained RNA, dsRNA)和模拟物poly(I：C),并通过唯一接头蛋白p干扰素TIR结构域衔接蛋白(TIR-domain-containing adaptor inducing interferon-β,TRIF)向下传递信号。在早期的研究中,TLR3是以介导抗病毒反应的身份出现的。而近年来的研究指出,TLR3可以作为不依赖病毒感染的内源性感受器,参与到炎症的发生过程中,并且可以通过正反馈调节来放大炎症反应。TLR3及其信号通路与脓毒症、类风湿性关节炎、慢性神经退行性病变等疾病的发病机制相关,成为极具潜力的治疗靶点。这提示我们,抑制巨噬细胞TLR3及相关通路的过度活化,可以作为对抗炎症反应的新策略。除了TLRs介导的炎性活化,巨噬细胞还可以通过不同方式的极化来发挥不同的功能。通过极化巨噬细胞可以分化成两种亚型,其中,M1型为炎性巨噬细胞,介导感染清除、炎症和组织损伤；M2型为抑炎型巨噬细胞,分泌IL-10、TGF-β等抑炎因子,参与免疫抑制功能和组织修复。在正常生理条件下,M1型与M2型巨噬细胞存在一种平衡关系,以维持内环境的稳态。研究表明,炎性疾病中M2型巨噬细胞数量的增加有利于炎症的消除。FC-99是一种通过化学方法合成的小分子化合物,它的结构简单,性能稳定,在前期的工作中,FC-99能够抑制poly(I:C)诱导的树突状细胞的成熟,但对于巨噬细胞的炎性活化及极化的影响还未可知。本论文通过借助该外源性小分子FC-99,对巨噬细胞的炎性活化及极化进行调控,进而达到缓解炎症性疾病的目的。1.外源小分子FC-99干预可抑制TLR3介导的巨噬细胞炎性反应首先,我们利用dsRNA的模拟物poly(I:C)激活巨噬细胞,来验证FC-99对TLR3介导的炎性活化的影响。TLR3识别配体poly(I:C)后,通过唯一接头蛋白TRIF来活化干扰素调节因子3 (Interferon regulatory factor 3,IRF3)、NF-κB (Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)、丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases,MAPK)等通路,分别参与介导抗病毒感染、细胞病变或死亡以及炎症反应。外源小分子化合物FC-99能够显著抑制poly(I:C)诱导的小鼠腹腔巨噬细胞炎症反应,具体效应表现为：poly(I:C)可以诱导腹腔巨噬细胞产生TNF-α、IL-6、CCL-5和IP-10等炎性细胞因子和趋化因子,而FC-99预处理则明显降低这些炎性因子的表达；相应的,与炎性因子生成相关的ERK、JNK、P38 MAPK和IκB等激酶的磷酸化水平也得到了不同程度的抑制。同时,我们研究了FC-99的细胞毒性及其对细胞摄入poly(I:C)能力的影响,确保实验所采用的浓度并不影响细胞活力和细胞对poly(I:C)的摄入。以上结果证实了新型小分子化合物FC-99能够抑制TLR3通路介导的炎症反应。2.FC-99通过IRF3/IFN-a/JAK/STATl通路降低TLR3的表达接下来,我们着重研究FC-99对炎性正调控枢纽TLR3的影响。在病毒性感染中,TLR3活化以后,激活TRIF-IRF3信号来诱导Ⅰ型干扰素(Interferon,IFN)等细胞因子的产生,从而遏制病毒感染。同时,在非病毒感染的模式下,TLR3还能识别降解细菌、损伤组织、死亡细胞释放的dsRNA结构甚至信使RNA,从而成为内源性危险信号分子模式(Danger-associated molecular patterns,DAMPs)的感受器。因此,TLR3的表达与活化维持着正常生理与炎症之间的平衡。研究表明,TLR3的过度表达能够加剧病毒诱导的炎症损伤,并介导自身免疫病和系统性炎症的发生。作为干扰素刺激基因(Interferon stimulated genes,ISGs),TLR3的表达可被Ⅰ型IFN诱导。在TLR3参与的炎症反应中,来自病原体的外源性dsRNA或由宿主释放的内源性核酸与TLR3结合,激活IRF3、MAPK、NF-κB等信号通路,启动炎性因子和Ⅰ型IFN的生成,而I型IFN又通过自分泌或旁分泌与相关受体相互作用,激活JAK/STAT通路,诱导TLR3的表达,上调的TLR3则进一步激活通路,放大炎性信号,形成正反馈调节环路。鉴于此,我们探讨了FC-99对TLR3表达的影响及可能的作用机制。结果表明,poly(I:C)诱导的TLR3依赖IFN-a,而FC-99可以通过抑制IFR3的磷酸化降低Ⅰ型IFN的产生。同时,对于外源IFN-a诱导的TLR3,FC-99同样可以发挥抑制作用,这提示我们在IFN通路中FC-99也存在着作用位点。进一步的结果显示,FC-99可以抑制IFN-a诱导的JAK1/STAT1的磷酸化。综合实验结果,我们对FC-99参与调控巨噬细胞炎性活化的过程做了如下概括：内源或外源性的dsRNA都可以与TLR3结合,启动下游信号通路。一方面,TLR3通过NF-κB和MAPK诱导炎性因子的表达,直接参与到炎症反应中；另一方面,又可以通过IRF3诱导Ⅰ型IFN,分泌的Ⅰ型IFN与相应的受体结合,通过JAK1/STAT1通路诱导TLR3的表达,而TLR3上调后大大增加了对刺激物的敏感性,进而放大了整个通路和炎性反应。FC-99的作用则体现在,一是抑制了炎性因子的表达,二是通过抑制IRF3的磷酸化降低了Ⅰ型干扰素的生成,从而减少了诱导TLR3表达的直接信号源；另外,FC-99还可通过抑制JAK1/STAT1通路进一步遏制TLR3的转录,三者综合作用阻滞了TLR3介导的正反馈调节环路。3.化合物FC-99通过PPAR-y促进巨噬细胞的M2型极化巨噬细胞是炎症应答的重要参与者,它的作用可以通过分化成不同的细胞亚型来发挥：经典通路活化的M1型巨噬细胞具有较强的杀菌能力,高表达iNOS. TNF-α、IL-12和IL-6等炎性因子,属于炎性巨噬细胞；旁路活化的M2型巨噬细胞属于抗炎巨噬细胞,主要参与感染源的清除和损伤组织的修复,高表达Mrc、Arg-1等标记,分泌的细胞因子以抑炎因子为主,如IL-10、TGF-β等。研究表明,维持M1与M2型巨噬细胞之间的平衡对于机体的代谢和稳态至关重要。巨噬细胞极化的机制还未明了,目前认为IL-4可以通过激活信号转导与转录激活因子6 (Signal transducer and activator of transcription 6,STAT6)并活化过氧化物酶体增殖物激活受体(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPAR-γ)来诱导巨噬细胞的M2型极化。前期的实验结果显示,FC-99能够诱导骨髓来源的巨噬细胞由M1型向M2型转换,这提示我们FC-99可能调控巨噬细胞的极化。接下来,利用巨噬细胞系RAW264.7的研究表明,FC-99能够促进IL-4对M2型极化的诱导作用,而FC-99单独作用也可以诱导M2型相关基因Mrc、Arg-1的表达。有趣的是,FC-99的作用机制不同于IL-4,它不能诱导STAT6的磷酸化,STAT6的表达也不影响FC-99对Mrc的诱导。但PPAR-γ的活性抑制剂可以抑制FC-99诱导的Mrc表达,同时,FC-99单独处理可促进PPAR-γ转录,与IL-4联用则增强了IL-4对PPAR-γ的诱导作用。综上我们推测,FC-99可能通过PPAR-γ促进巨噬细胞的M2型极化,从另一方面发挥抗炎功效。4.TLR3的降低与巨噬细胞M2型极化有助于改善小鼠脓毒症脓毒症是全身性的重症炎症反应,发病过程中伴随着严重的并发症如急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合症、多器官功能障碍等,临床发病率与死亡率都很高。目前针对脓毒症的治疗策略有PAMPs中和抗体、炎性细胞因子中和抗体、TLR4通路抑制剂等,但在临床实验中都未能取得很好的疗效,因此,需要应用新的思路来治疗脓毒症。TLR3是内源性危险信号的感受器,在脓毒症中参与调控炎症的级联反应。敲除TLR3可明显改善小鼠脓毒症模型的症状及存活率,这提示我们,合理调控TLR3的表达有利于治疗脓毒症。前期研究表明,FC-99具有良好的抗炎活性,能降低TLR3的表达并阻止TLR3介导的炎症级联反应,并通过PPAR-γ诱导巨噬细胞M2型极化,因此我们建立了盲肠结扎穿孔(Cecal ligation and puncture,CLP)诱导的小鼠脓毒症模型,考察FC-99在体内的生物学效应。结果表明,FC-99可显著改善小鼠脓毒症病症,包括降低血液中炎性因子TNF-α、 IL-6、KC和CCL-5的水平,改善肝脏、肾脏的功能障碍和急性肺损伤,抑制腹腔细胞凋亡,提高机体对细菌的清除能力和存活率等。同时,我们也检测了体内实验中FC-99对TLR3的表达及巨噬细胞M2型极化的影响,结果显示FC-99降低了脓毒症小鼠脾脏CD11b+细胞及局部组织(肺部、肝脏和肾脏)中TLR3的表达,并且促进了肝脏M2型巨噬细胞相关基因的表达。综上所述,外源小分子FC-99可以抑制TLR3配体—poly(I:C)诱导的炎症反应,并通过IRF3/IFN-O/JAK/STAT1通路抑制TLR3的表达,从而阻遏TLR3介导的炎症的正反馈。除此之外,FC-99还能通过PPAR-γ诱导巨噬细胞的M2型极化,发挥抑炎功能。FC-99对小鼠脓毒症的改善可能依赖于以上所述的抑炎功能,这就为脓毒症的临床治疗提供了新的思路。