论文部分内容阅读
背景高危型人乳头瘤病毒(high-riskhuman papillomaviruses,HR-HPVs),特别是HPV16和HPV18是引起宫颈癌(cervical carcinoma)的主要原因,其E6和E7基因的产物通过与感染细胞内靶点的相互作用诱导感染细胞发生恶性转化。集聚蛋白(Agrin)是细胞外基质(extracellular matrix,ECM)组成成分——硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparansulfate proteoglycan,HSPG)的一种,HSPG通过参与病毒的初始结合、储存、侵入过程和转录反式激活等在病毒感染中发挥重要作用。基因表达谱芯片分析发现,Agrin是正常宫颈上皮和宫颈癌组织间的一个差异表达基因,未见深入研究的相关报道。HR-HPVs相关宫颈癌发生发展中Agrin的作用、机制尚不清楚。目的本研究拟以HPV16阳性的宫颈癌Caski细胞和SiHa细胞、HPV18阳性的宫颈癌HeLa细胞、HPVs阴性的宫颈癌C33-A细胞为研究对象,研究HR-HPVs相关宫颈癌发生发展中集聚蛋白(Agrin)的作用,以丰富HR-HPVs的致癌机制。方法1.通过实时定量聚合酶链式反应(real-time quantitative PCR,qPCR)和Western blotting方法检测Agrin在HPV16阳性宫颈癌Caski细胞和SiHa细胞、HPV18阳性宫颈癌HeLa细胞、HPVs阴性宫颈癌C33-A细胞中的表达。2.运用qPCR和Western blotting方法检测β-catenin在HPV16阳性宫颈癌Caski细胞、HPV18阳性宫颈癌HeLa细胞、HPVs阴性宫颈癌C33-A细胞中的表达。3.通过免疫荧光共定位技术验证Agrin和β-链蛋白(β-catenin)在HR-HPVs相关宫颈癌细胞中的相互作用。4.设计并合成以Agrin mRNA为靶点的小干扰RNA(small interferingRNA,siRNA)和阴性对照(negative control,NC)siRNA,分别命名为siRNA-Agrin和siRNA-NC。5.将siRNA-Agrin和siRNA-NC经脂质体介导分别转入HPV16阳性宫颈癌Caski细胞、HPV18阳性宫颈癌HeLa细胞中,其中转染siRNA-Agrin的Caski细胞和HeLa细胞分别命名为Caski-siRNA-Agrin细胞和HeLa-siRNA-Agrin细胞,转染siRNA-NC的Caski细胞和HeLa细胞分别命名为Caski-siRNA-NC细胞和HeLa-siRNA-NC细胞。然后通过qPCR和Western blotting方法检测沉默效果。6.通过CCK8实验、Transwell迁移和侵袭实验、划痕实验等方法观察Agrin沉默对Caski细胞和HeLa细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。结果1.qPCR和Western blotting方法结果均显示:与C33-A细胞相比,Caski细胞、SiHa细胞和HeLa细胞中Agrin mRNA和蛋白的表达均显著增加(P<0.01或0.05),Agrin mRNA和蛋白在4种宫颈癌细胞中表达的顺序均为:C33-A细胞<SiHa细胞<Caski细胞和HeLa细胞。2.qPCR和Western blotting方法结果均显示:β-catenin mRNA和蛋白在Caski细胞和HeLa细胞中的表达显著高于其在C33-A细胞中的表达(P<0.01)。3.免疫荧光共定位技术检测Agrin与β-catenin相互作用的结果显示:Caski细胞、HeLa细胞、C33-A细胞中均存在Agrin与β-catenin的共定位,共定位于细胞膜和细胞质。4.Western blotting和qPCR方法检测结果显示:Agrin在Caski-siRNA-Agrin和HeLa-siRNA-Agrin细胞中的表达分别显著低于其在Caski-siRNA-NC和HeLa-siRNA-NC细胞中的表达(P﹤0.01)。与Caski和HeLa细胞相比,Agrin在Caski-siRNA-NC和HeLa-siRNA-NC细胞中的表达无明显差异(P﹥0.05)。5.CCK8检测结果显示:与Caski-siRNA-NC细胞和HeLa-siRNA-NC细胞相比,Caski-siRNA-Agrin和HeLa-siRNA-Agrin细胞生长速度明显减慢(P<0.01)。6.Transwell迁移和侵袭实验结果均显示:Caski-siRNA-Agrin细胞和HeLa-siRNA-Agrin细胞穿过小室底膜的细胞数分别显著少于Caski-siRNA-NC细胞和HeLa-siRNA-NC细胞(P<0.01)。7.划痕实验结果显示:与Caski-siRNA-NC细胞和HeLa-siRNA-NC细胞相比,Caski-siRNA-Agrin和HeLa-siRNA-Agrin细胞迁移速度明显减慢。结论1.HPV16和HPV18引起的宫颈癌中Agrin具有重要作用,其作用可能涉及β-catenin。2.Agrin表达沉默可显著抑制HR-HPVs相关宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。