慢性骨疾病如骨质疏松、成骨不全等，是最为常见的骨代谢异常疾病，也是导致骨折和骨缺损的主要原因之一，并严重影响到牙齿、牙周组织以及颌骨的健康。骨代谢异常时，可能会打破自体干细胞内环境的稳态，从而抑制干细胞的生物学特性和功能，影响骨组织的再生与修复。骨髓间充质干细胞（BMSCs）因其具有自我更新及多向分化潜能，已成为骨再生的重要种子细胞，对骨缺损有较好的修复能力。然而，在慢性骨疾病环境下，BMSCs会因不良的微环境和局部营养供给的影响而使其生物学活性和功能受到抑制，影响骨修复能力。近年来发现的血管内皮祖细胞（EPCs）被证实具有新生血管、促进局部营养支持和改善微环境的功能。因此，我们希望可以利用EPCs来促进BMSCs的生物学活性和功能，以提高BMSCs的骨再生能力。本实验通过建立Transwell间接共培养体系，来探索EPCs是否具有提高大鼠BMSCs（rBMSCs）生物学特性的功能，为进一步促进BMSCs的骨修复能力奠定理论基础，对开发治疗骨质疏松等新的治疗策略具有重要意义。研究目的1.探讨间接共培养条件下，EPCs对rBMSCs细胞转归的影响。2.探讨间接共培养条件下，EPCs对rBMSCs干性的调控作用。3.探讨间接共培养条件下，EPCs对rBMSCs增殖、凋亡、分化的调控作用。4.探讨EPCs对rBMSCs体内骨修复能力的影响。研究方法1.利用密度梯度离心法结合全骨髓贴壁法分离培养rBMSCs，倒置显微镜观察细胞形态；流式细胞技术检测细胞表面分子的表达；克隆集落形成、MTT法检测细胞增殖能力。成骨、成脂诱导检测细胞多向分化能力。2.采用密度梯度离心法分离出骨髓中单个核细胞，利用条件培养基结合差速贴壁法进行培养和纯化EPCs，通过对原代细胞形态学特征的连续性观察、细胞分子表型基因的表达检测、体外小管形成实验以及免疫组化和免疫双荧光染色等方法对EPCs进行综合鉴定。3.建立EPCs、BMSCs transwell间接共培养体系，RT-PCR、流式细胞仪以及DiI-acLDL荧光染色检测BMSCs细胞的转归。4.间接共培养后，RT-PCR检测干性转录因子在rBMSCs中的表达情况，real-timePCR检测其基因表达量的变化；EDU荧光标记法、CFU-F形成率及流式细胞仪检测BMSCs增殖及凋亡情况；ALP染色、酶活性定量检测以及茜素红染色观察BMSCs碱性磷酸酶和钙化结节的形成情况，real-time PCR和Western blot检测成骨标志性基因的表达量变化；油红O染色观察EPCs对BMSCs成脂分化的影响，real-time PCR和Western blot检测成脂相关基因及蛋白的表达量变化。5.建立大鼠牙槽骨缺损模型，将经EPCs作用过的rBMSCs复合生物支架材料移植入骨缺损区，通过CM-Dil荧光标记进行细胞体内示踪，对术后的标本组织进行大体观察，MicroCT扫描、新骨骨密度检测以及组织HE染色来检测BMSCs的骨再生能力。实验结果1.体外分离培养的rBMSCs多呈长梭形、多角形，可以形成单细胞克隆集落，细胞增殖呈典型的―S‖形，表达间充质细胞表面标志物，而不表达造血系细胞的标志物，并具有成骨、成脂分化的能力，证明所培养的细胞是BMSCs。2.经过条件培养基结合差速贴壁法培养的单个核细胞在原代早期呈长梭形，而晚期则转变为铺路石状。细胞同时具有造血干细胞和内皮细胞表面标志物的双重表达，体外可以形成类似微血管样的结构，并且对单核细胞及内皮细胞特异分子免疫组化及双荧光染色呈阳性表达，证实所分离培养的单个核细胞为EPCs。3.与EPCs间接培养后的BMSCs，其细胞形态及细胞表面分子的表达与对照组相比，没有明显差别。因此，在间接共培养条件下，EPCs并未明显改变BMSCs的细胞表型。4.间接共培养后，EPCs可以有效维护rBMSCs干性转录因子的基因表达量，并增强BMSCs细胞DNA合成能力和细胞增殖能力，但对BMSCs的凋亡没有明显调控作用。另外，EPCs的间接刺激可以有效促进rBMSCs体外成骨及成脂分化能力。5. EPCs于体外间接作用后，可以增强BMSCs在体内的骨修复能力。结论1.间接共培养条件下，EPCs不会改变BMSCs细胞表型特征。2.间接共培养条件下，EPCs能够维持BMSCs的细胞干性，并促进其体外增殖及分化能力，但对BMSCs的细胞凋亡没有影响。3.经EPCs间接刺激后的BMSCs，其修复牙槽骨缺损的能力明显提高。