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猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)是严重威胁世界各国养猪业的重要病原之一。PRRSV感染可引起母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病,并导致机体产生免疫抑制。PRJRSV分为欧洲型和美洲型两个血清型,病毒基因组ORF1编码13种非结构蛋白,ORF2-7编码7种结构蛋白,其中NSP1能够抑制IFN-β启动子活性和Ⅰ型干扰素的产生。本研究成功制备出6株针对NSP1蛋白的单克隆抗体,并鉴定获得两个线性表位(54-59aa和157-163aa)和一个不连续性表位(185-232aa)。同时,利用生物信息学和IFN-γELISPOT试验在ORF3-7编码蛋白上鉴定出7个T细胞表位,并根据T、B细胞表位设计合成两种新的抗原分子。构建成功的真核表达质粒,可以有效表达目的蛋白,小鼠基因免疫试验证明,SynBT2重组质粒DNA可有效诱导产生细胞和体液免疫应答,为PRRSV疫苗研究奠定重要基础。主要研究内容分为以下4个部分：1.猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP1非结构蛋白原核表达与单克隆抗体研制根据GenBank Accession No. EU144079,设计针对PRRSV SY0608NSP1基因的特异性引物,扩增获得长1149bp的特异性DNA片段。将目的片段克隆至原核表达载体pET-32a中,通过IPTG诱导含pET-32a-NSP1的大肠杆菌BL21,证明重组蛋白获得有效表达。SDS-PAGE和Western blot分析证明,NSP1可以自身裂解形成NSP1α和NSP1β37℃条件下诱导表达,重组蛋白主要形成包涵体,以NSP1全长蛋白的形式存在。18℃条件下诱导,重组NSP1蛋白可以完全裂解为NSP1α和NSP1β。 Western blot分析表明,重组蛋白均可被猪源PRRSV阳性血清所识别。将纯化的重组NSP1蛋白与等量弗氏佐剂乳化,经颈背部多点皮下注射免疫BALB/c小鼠3次后,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA、Western blot和IFA,筛选获得PRRSV NSP1抗体阳性杂交瘤细胞,经过3次亚克隆后,最终获得6株能稳定分泌抗NSP1抗体的阳性杂交瘤细胞株。间接ELISA、IFA和Western blot鉴定表明,这6株单克隆抗体均能够特异地识别NSP1蛋白,能够识别感染MARC-145细胞和猪肺泡巨噬细胞(PAM)的美洲型PRRSV,并产生特异性的荧光,而单抗1H7、3C7和4H2不能特异性识别感染PAM细胞的欧洲型PRRSV,该研究为NSP1抗原表位鉴定和PRRS诊断奠定了基础。2.猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP1非结构蛋白B细胞表位的鉴定设计36个截短NSP1基因片段,以pET-32a-NSP1为模板,通过PCR扩增所有片段,克隆至pET-32a载体中。利用大肠杆菌BL21诱导表达36个重组截短NSP1蛋白。通过间接ELISA和Western blot方法精确定位单克隆抗体所识别的表位,结果为：单抗4H2能够识别NSP1α的E (54) EPLRW (59),单抗2G5、3E11和4D4识别NSP1α的H(157) VLTNLP (163).单抗3C7和1H7识别NSP1β蛋白的185aa-232aa位点,该表位为不连续性表位。为了进一步证明所鉴定的表位是否准确,合成2个肽段(SP)E (54) EPLRW (59)和H (157) VLTNLP (163),采用Pepscan的方法分析发现,单抗4H2能够识别肽段E (54) EPLRW (59),单抗2G5、3E11和4D4能够识别肽段H(157) VLTNLP (163).鉴定的3个NSP1表位均能够与PRRSV阳性血清反应,但免疫反应较弱。不同PRRSV毒株序列分析发现,表位E (54) EPLRW (59)在15株北美型PRRSV中高度保守,而与欧洲型毒株相比变异较大；表位H(157) VLTNLP(163)在19株PRRSV中均高度保守,在欧洲型毒株中仅有一个氨基酸的变异(L162→S162)；表位185-232aa在美洲型毒株中相对保守,与欧洲型毒株相比变异较大。以上结果丰富了PRRSV非结构蛋白NSP1抗原表位图谱,为进一步研究NSP1蛋白相关功能奠定了基础。3.猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF3-7结构蛋白T细胞表位的解析本研究通过生物信息学预测该病毒GP3、GP4、GP5、M和N结构蛋白上可能的T细胞表位,合成24条9个氨基酸多肽。同时,利用24头清洁级仔猪接种PRRSVSY0608毒株,于接种后42和63d采血分离外周血淋巴细胞体外培养,并用上述多肽进行刺激,通过ELISPOT试验检测多肽刺激后特异性IFN-γ的分泌量,结果为：24条多肽中有7条多肽可以刺激PBMC细胞产生IFN-γ,证明其为T细胞表位,分别位于GP3蛋白的106-114aa (GP3-3)、GP4蛋白的8-16aa (GP4-3)、GP5蛋白的119-127aa (GP5-1)和151-159aa (GP5-2)、M蛋白的43-51aa(M-1)和106-116aa (M-2), N蛋白的25-33aa(N-1),其中,4个表位为首次发现。将表位序列在不同毒株的PRRSV序列中进行比对,发现GP3-3、M-1、M-4和N-1在美洲型毒株中完全保守,GP4-3、 GP5-1和GP5-2在不同美洲型毒株中存在1-4个氨基酸的变异。本研究鉴定的T细胞表位为设计开发新型抗PRRSV疫苗奠定了基础。4. PRRSV结构蛋白BT细胞表位基因疫苗抗原分子设计与免疫特性研究根据GP3、GP4、GP5和M结构蛋白B细胞表位富集区和T细胞表位基因序列,设计两种基因组合的DNA分子,不同表位之间插入柔性氨基酸,基因序列按照猪源偏嗜性密码子进行优化处理。利用真核表达载体pVAX1,构建重组真核质粒pVAX1-SynBT1、pVAXl-SynBT2、pVAX1-SynB和pVAX1-SynT, Western Blot试验结果证明pVAXl-SynBT1、pVAX1-SynBT2、pVAX1-SynB表达蛋白具有PRRSV抗原性。取70只Balb/c小鼠,分为7组,每组10只。第1、2、3、4、5和6组分别腿部肌肉注射免疫pVAX1-SynBT1、pVAX1-SynBT2、pVAXl-SynB、pVAXl-SynT、pVAX1-SynGP5/GP4-5和pVAXL质粒DNA,剂量为每只小鼠免疫100μg,第7组为阴性对照组,注射PBS。首免后21、42d分别以相同的剂量加强免疫。首次免疫后42和63d采血测定PRRSV特异性ELISA抗体和中和抗体,同时,取脾脏分离淋巴细胞测定淋巴细胞增殖反应,并测定脾脏淋巴细胞体外刺激后细胞因子应答,结果为：首免后9周pVAX1-SynBT1、pVAX1-SynBT2和pVAX1-SynGP5/GP4-5免疫组小鼠均能够产生PRRSV特异性抗体以及细胞免疫应答。其中,pVAX1-SynBT2免疫组的PRRSV特异性ELISA抗体和中和抗体水平明显高于其它组,其PRRSV抗原刺激产生的IL-4及IFN-γ细胞因子应答均显著高于其它各免疫组。该研究结果表明,SynBT2重组质粒DNA能够有效诱导小鼠产生细胞和体液免疫应答,为PRRSV基因疫苗的研究奠定基础。