研究背景牙髓病、根尖周病是口腔科的常见病,多发病,其主要治疗方法是根管治疗,即在摘除感染坏死的牙髓组织、去除根管内感染物质的基础上,用根管充填材料封闭原来牙髓组织所占据的空间,阻止细菌的侵入,以达到消除炎症的目的。由于牙髓组织完全破坏,牙齿失去营养支持,丧失了原来的感觉及代谢功能,牙体变色,影响美观,牙体组织变脆易折,需要进行冠修复。同时,根管治疗的技术敏感性较高,需要精密的仪器和较高的技术,治疗过程较为复杂。根管治疗及后续的冠修复均为非生物修复,不能形成健康美观的自然牙、生物牙。由于年轻恒牙自身解剖特点,牙根发育不完全,根尖孔尚未形成,根尖呈开放状态。当年轻恒牙出现牙髓严重病变或根尖周感染时,由于开放的根尖无法形成有效的封闭,不能进行常规的根管治疗。目前,对于年轻恒牙根尖周炎的常规治疗方法有手术后倒充填治疗和根尖诱导成形术后再进行根管治疗。根尖手术后倒充填治疗无法促进牙根的继续发育,常导致牙根变短,冠根比加大,患牙远期保存效果差。另一种治疗方法是进行根尖诱导成形术,使根尖部形成牙本质桥,封闭根尖孔。近年来,有临床研究和一系列病例报道均表明,牙髓坏死的年轻恒牙经过根管消毒、诱导血液进入根管和冠部的严密封闭,能够获得牙根的继续发育和新生组织长入根管,X线表现为牙根变长、根管壁增厚、根尖孔闭合和根尖病变消失,同时牙齿重新获得牙髓活力,这一治疗方法称为“牙髓再血管化”(Pulp Revascularization)。然而,在取得良好临床疗效的同时,相应的动物实验却证实,根管内的新生组织与正常牙髓完全不同,是由类牙骨质、骨样组织,牙周膜样组织和疏松结缔组织组成的。如何使新生的“再血管化”组织更加接近正常牙髓的组织结构和功能,是目前“牙髓再血管化”研究中面临的最关键问题。要解决这一问题,就需要对牙髓再血管化过程中干细胞成分的来源、不同来源干细胞之间竞争增殖的机制进行深入系统的研究。牙根继续发育、新生组织的细胞来源和牙髓再血管化的确切机理仍然不清楚。多数学者推测其细胞有多种来源,包括残存活髓组织的牙髓干细胞(DPSCs)、根尖牙乳头干细胞(SCAPs)、牙周膜干细胞(PDLSCs)和骨髓干细胞(BMMSCs)。事实上,牙髓坏死和严重的根尖周感染(根尖病变的存在),以及根管消毒和冲洗药物会显著损伤牙髓干细胞和根尖牙乳头干细胞,这两组干细胞参与牙髓再血管化的可能性很小。因此,我们提出假设：骨髓来源细胞可能参与牙髓再血管化的过程,是新生组织的主要细胞来源。研究目的和内容本实验拟通过建立小鼠磨牙去髓后牙髓再血管化模型,明确小鼠牙髓再血管化的发生过程及组织学特点。进一步通过建立小鼠GFP+骨髓嵌合体模型,观察骨髓来源细胞参与维持颌骨和牙齿组织及全身其他组织稳定中的作用。并通过对GFP+骨髓嵌合体小鼠磨牙进行牙髓再血管化处理,探讨骨髓来源细胞在牙髓组织再血管化过程中的相关机制。为后续实验如何调节骨髓来源细胞在牙髓组织再血管化过程中的增殖和分化奠定基础。材料与方法(1)选取4周龄C57BL/6小鼠经腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉,使用自行设计的小鼠专用固定和口腔牵拉装置将小鼠固定置于口腔手术显微镜下,碘酒消毒手术野,并放置吸唾器,全部实验过程保持无菌操作。对实验牙进行牙髓再血管化处理,使用高速不锈钢球钻(#1/4)从牙合面进行开髓,然后用6#K锉去除牙髓,生理盐水冲洗,6#和8#K锉继续清理根管内残留的牙髓,并适当扩大根尖孔,生理盐水冲洗根管,无菌纸尖吸干,8#K锉插入根尖,刺激根尖周组织出血至根管口水平,置一生理盐水湿棉球,等待5分钟让血液形成血凝块,MTA覆盖,光固化流动树脂严密封闭开髓孔。分别于术后1周,4周,8周处死动物,进行影像学和组织学观察牙髓再血管化情况。(2)通过将GFP+转基因小鼠骨髓细胞移植到经放射性照射处理的野生型C57BL/6小鼠体内,形成GFP+骨髓嵌合体小鼠,通过小动物活体成像和组织学方法观察骨髓来源细胞在牙髓、牙周组织、心脏、肺脏、脂肪、皮肤、肾脏等组织的分布。(3)在建立好的GFP+骨髓嵌合体小鼠模型的基础上,对嵌合体小鼠第一磨牙进行牙髓再血管化处理,并通过小动物活体成像、影像学、组织学及免疫组织化学分析牙髓再血管化的情况,以及骨髓来源细胞在牙髓再血管化过程中的作用,并探讨骨髓来源细胞参与牙髓再血管化过程的相关机制。结果(1)通过采用自行设计的小鼠口腔显微手术固定及牵引装置辅助下,充分暴露小鼠口腔术区,小鼠上下颌磨牙区充分暴露,成功对小鼠上下颌第一磨牙进行牙髓再血管化模型的建立,实验期间动物生长情况良好,实验牙牙体无折裂或松动,充填物无脱落,牙周组织无异常。口腔黏膜无明显红肿。影像学结果显示实验组第一磨牙髓腔见致密充填物影像覆盖根管口,上方充填物完好,无脱落；根管腔可见,根尖1/3根管腔缩窄,有新生硬组织形成,根尖周组织和牙周组织未见明显异常。对照组(根尖周炎)结果显示第一磨牙髓腔开放,与外界相通,根管腔可见,近远中根尖1/3可见牙周膜间隙增宽,骨硬板消失,根尖周骨质破坏。根分叉区亦出现较大范围低密度影像,提示小鼠下颌第一磨牙可能存在副根管。组织学结果显示实验组根管腔1/2均长满了高度血管化的组织,近根尖部见大量钙化组织,钙化组织内包绕少量高柱状细胞,根管内壁可见硬组织沉积,表面有胞体大、胞核深染、呈高柱状的成牙本质样细胞层,可见细胞呈假复层状排列,类似成牙本质细胞层。髓腔内可见骨样组织,不规则形的骨样细胞位于陷窝内,骨样组织的细胞数目较多。对照组根管腔空如,仅存少量中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等慢性炎症细胞浸润。影像学和组织学结果均提示成功建立小鼠去髓后牙髓再血管化动物模型。(2)GFP+转基因小鼠骨髓细胞移植到经放射性照射处理的野生型C57BLP6小鼠体内后,小鼠在14天内相继出现了体重下降,食欲减弱、轻微腹泻、脱毛、活力下降,毛发灰白伴脱毛等症状。小鼠移植后精神萎靡体重减轻在2周后逐渐恢复,全部存活超过120天。流式细胞仪结果显示移植小鼠外周血单核细胞绿色荧光比例都高于90%,嵌合成功率高,成功建立GFP+骨髓嵌合体模型。骨髓移植2月后,小动物活体成像结果显示移植后的小鼠四肢和头部颌骨区域均可见较为明显的绿色荧光,颌骨区域绿色荧光较其他区域更强；组织学结果显示可在多种组织内观察到GFP+的骨髓来源细胞。包括肝脏、肺脏、心脏、肾脏、皮肤、脂肪、牙髓、牙周组织等。其中迁移到牙髓和牙周组织中的GFP+的骨髓来源细胞多于其他组织。(3)对嵌合体小鼠第一磨牙进行牙髓再血管化处理后,小动物活体成像结果显示,与未处理的小鼠相比,实验组(牙髓再血管化)和对照组(根尖周炎)所在颌骨区域绿色荧光蛋白均有增加,其中实验组绿色荧光蛋白表达量增加明显高于对照组,至术后第8周时两组绿色荧光蛋白表达量无明显差异,但与空白对照(未做任何处理)组相比仍处于较高的水平。进一步的免疫组织化学结果显示可见GFP+的骨髓来源细胞出现在再血管化的牙髓样组织中,并分化成成牙本质细胞、血管组织、神经组织等。提示在出现组织损伤的情况下,骨髓来源细胞可迁移至损伤处,参与新生组织的形成。结论(1)自行设计的小鼠口腔显微手术固定及牵引装置,可充分暴露小鼠口腔术区,可对小鼠上下颌第一磨牙进行牙髓再血管化模型的建立,具有操作简便,节约手术时间,并能有效提高牙髓再血管化处理的成功率。影像学和组织学结果显示成功建立小鼠去髓后牙髓再血管化动物模型。(2)通过将GFP+转基因小鼠骨髓细胞移植到经放射性照射处理的野生型C57BLP6小鼠体内后,流式细胞仪结果显示移植小鼠外周血单核细胞绿色荧光比例都高于90%,成功建立GFP+骨髓嵌合体模型。骨髓移植2月后,骨髓来源细胞可迁移至小鼠四肢和头部颌骨区域,其中迁移到牙髓和牙周组织中的GFP+的骨髓来源细胞多于其他组织。(3)对嵌合体小鼠第一磨牙进行牙髓再血管化处理后,小动物活体成像结果提示在出现组织损伤的情况下,骨髓来源细胞可迁移至损伤处,参与新生组织的形成。组织学结果发现,再血管化的牙髓样组织中有较多的骨髓来源细胞表达,并可分化成成牙本质细胞、血管组织、神经组织等。综上所述,本研究证实,牙髓再血管化过程中进入根管的细胞有多种组织来源,其中骨髓来源细胞通过迁移进入根管腔并成牙本质细胞、牙周膜、血管组织、神经组织参与牙髓再血管化过程。