论文部分内容阅读
背景和目的随着生存环境的改变和人群生活水平的提升,2030年我国糖尿病(diabetes mellitus,DM)患者人数将突破4320万。糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是DM患者眼部微血管并发症之一,是导致DM患者视力下降和丧失的主要原因,其发病率随着DM病程的进展而升高。DR的发生发展由多种病理机制共同调控,包括氧化应激反应、多元醇通路、晚期糖基化终产物、己糖胺通路和蛋白激酶C通路等。目前DR的临床治疗方法包含:视网膜激光光凝、玻璃体切割术(pars plana vitrectomy,PPV)和玻璃体腔注射药物治疗等。激光光凝治疗相对安全且疗效持久,但会损害患者的视觉质量;PPV虽能保留患者部分视力,但手术创伤较大;DR早期可以应用药物治疗,但糖皮质激素类药物具有明确的副作用;抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)药物治疗能从发病机制上有效抑制DR的发生发展,但疗效相对较短。因此开发新型、无副作用且疗效长的药物对于DR的治疗有重大的经济和社会意义。白细胞介素-18(interleukin-18,IL-18)是一种促炎细胞因子,可以调节趋化因子、黏附分子、γ-干扰素等的产生和表达,对体内炎症反应的产生发展起重要作用。因此本研究拟通过体内外实验初步探讨IL-18是否参与DR的发生发展,并进一步探讨其在DR中的作用及机制,以期为DR的治疗提供新的靶标,进而寻求新的治疗策略,为DR的治疗提供新的思路和临床依据。方法1.体内实验:以SPF级8周龄雄性C57BL/6J小鼠为研究对象,DM组小鼠空腹12h后按65mg/kg体重腹腔注射链脲佐菌素,连续注射5天,1周后测空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)值高于 11.1mmol/L,成功诱导 Ⅰ 型 DM 小鼠模型。对照(control,CON)组小鼠相同条件下注射等量柠檬酸缓冲液。监测并记录DM组和CON组小鼠的体重和FBG。分别采集各时间点DM组及CON组小鼠眼球,固定眼球后取小鼠视网膜并充分研磨,提取视网膜总RNA,实时聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative PCR,RT-PCR)检测小鼠视网膜组织中IL-18、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)mRNA 的表达水平。2.体外实验:以人脐静脉内皮细胞EA.hy926为研究对象,在细胞的对数生长期,分别用完全培养基、含不同浓度高糖(high glucose,HG)的完全培养基和含等摩尔浓度甘露醇(mannitol,Man)的完全培养基孵育细胞,24h后,CCK8法检测细胞存活率,确定HG干预浓度,成功构建体外细胞模型。将细胞分为CON组、HG组等不同的培养条件孵育细胞24h,提取RNA,使用RT-PCR检测EA.hy926细胞IL-18、TNF-α、IL-1β、IL-6mRNA的表达,使用流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期分布,使用免疫荧光染色等检测细胞IL-18的定位及表达,从而阐明IL-18对DR相关的炎症因子表达的调控作用及其机制。3.本次研究数据均为≥3个独立实验的平均值±标准差,使用SPSS 21.0统计学分析软件进行统计学分析,组间差异通过方差分析和Dunnett检验进行评估,P<0.05时差异具有统计学意义。结果1.成功构建Ⅰ型DM小鼠模型,与CON组相比,DM组小鼠FBG值高于11.1mmol/L,并表现出DM体重减轻的症状。与CON组小鼠1周(22.71±1.50g)、2 周(22.99±1.50g)、3 周(27.00±1.27g)、4 周(26.78±1.71g)体重相比,DM组小鼠 1 周(19.39±1.03g)、2 周(18.95±1.48g)、3 周(18.96±1.33g)、4 周(21.27±1.10g)体重均显著降低(P<0.01)。与CON组小鼠 1周(5.90±1.05mmol/L)、2 周(5.65±1.07mmol/L)、3 周(5.41±1.12mmol/L)、4 周(4.45±1.12mmol/L)FBG 水平相比,DM 组小鼠在 1 周(18.91±2.90mmol/L)、2 周(16.16±3.87mmol/L)、3 周(25.20±2.95mmol/L)、4 周(29.70±2.40mmol/L)FBG水平均显著升高(P<0.01)。2.提取造模成功后1周、2周、3周、4周CON组和DM组小鼠视网膜组织中的RNA。与CON组小鼠IL-8 mRNA表达水平相比,DM组小鼠1周(1.76±0.23)、2 周(1.75±0.13)、3 周(1.99±0.23)、4 周(2.66±0.16)IL-18 mRNA相对表达水平均显著升高(P<0.01)。与CON组小鼠TNF-α mRNA表达水平相比,DM 组小鼠 1 周(3.34±0.22)、2 周(3.13±0.14)、3 周(3.81±0.22)、4 周(3.66±0.16)TNF-α mRNA相对表达水平均显著升高(P<0.01)。与CON组小鼠 IL-1βmRNA表达水平相比,DM 组小鼠 1 周(1.55±0.21)、2 周(1.36±0.19)、3周(2.07±0.13)、4周(2.49±0.12)IL-1β mRNA相对表达水平均显著升高(P<0.01)。与CON组小鼠IL-6 mRNA表达水平相比,DM组小鼠1周(1.35±0.20)、2 周(1.71±0.22)、3 周(2.13±0.14)、4 周(2.41±0.14)IL-6mRNA相对表达水平也显著升高(P<0.01)。3.确定适宜的HG孵育浓度,取对数生长期的EA.hy926细胞,分别用完全培养基(CON组)、含30mM、40mM、50mM、60mMHG的完全培养基和含同等摩尔浓度Man的完全培养基孵育细胞24h。CCK8结果显示,与CON组相比,50mMHG组可以抑制细胞增殖(91.50±1.73),50mMMan组对细胞增殖无明显影响(96.80±1.63)(均为P<0.01)。4.取对数生长期的EA.hy926细胞,分别用完全培养基(CON组)、含HG(50mM)、IL-18(1ng/mL)和 HG(50mM)+IL-18(1ng/mL)的完全培养基孵育细胞24h,收集细胞后用流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期分布。流式细胞仪分析结果显示,与CON组细胞凋亡率(1.79±0.77)相比,HG组(14.81±0.77)、IL-18组(5.56±1.39)及HG+IL-18组(15.70±2.14)可以促进细胞凋亡(均为P<0.01)。HG 组、IL-18 组、HG+IL-18 组诱导 EA.hy926 细胞 G0/G1 期阻滞。CON组45.4%的细胞聚集在G1期,而HG组62.8%的细胞聚集在G1期(P<0.01),IL-18组61.9%的细胞聚集在G1期(P<0.05),HG+IL-18组57.7%的细胞聚集在G1期(P<0.05)。HG、IL-18可能会导致部分细胞停滞于G0/G1期。5.取对数生长期的EA.hy926细胞,分别用完全培养基(CON组)、含HG(50mM)、IL-18(1ng/mL)、HG(50mM)+IL-18(1ng/mL)的完全培养基孵育细胞24h,提取各组细胞的总RNA。与CON组细胞IL-18 mRNA表达水平相比,HG 组(3.07±0.53)、IL-18 组(4.6 7±0.13)和 HG+IL-18 组(5.12±0.21)IL-18 mRNA相对表达水平均显著升高(P<0.01)。与CON组细胞TNF-α mRNA表达水平相比,HG 组(3.20±0.21)、IL-18 组(3.58±0.18)和 HG+IL-18 组(3.95±0.21)TNF-αmRNA相对表达水平均显著升高(P<0.01)。与CON组细胞IL-1β mRNA表达水平相比,HG 组(2.35±0.13)、IL-18 组(2.76±0.52)和 HG+IL-18 组(3.03±0.35)IL-1βmRNA相对表达水平均显著升高(P<0.01)。与CON组细胞IL-6 mRNA 表达水平相比,HG 组(2.55±0.13)、IL-18 组(2.46±0.55)和 HG+IL-18组(2.86±0.13)IL-6 mRNA相对表达水平均显著升高(P<0.01)。结果表明,HG、IL-18的刺激可以增加细胞IL-18、TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA的表达,HG+IL-18的共同刺激下期表达量更高。6.细胞免疫荧光分别检测CON、HG、IL-18和HG+IL-18不同干预条件下EA.hy926细胞中IL-18的表达。结果显示,Hoechst33342染液将细胞核染成亮蓝色,CON组IL-18几乎全部分布于胞浆中,颜色较浅,经过HG和IL-18的刺激,胞浆中的IL-18表达增多。结论1.本研究表明,IL-18在体内是DM引起的视网膜损伤的相关促炎因素,在DR的发生发展中起重要作用。2.HG、IL-18 均可以诱导 EA.hy926 细胞 IL-18、IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的上调促进炎症反应,造成血管内皮细胞损伤。其作用机制与促进细胞凋亡,诱导细胞周期阻滞,抑制细胞增殖相关。