【摘 要】
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水稻（Oryza sativa L.）是世界主要粮食作物之一,具有重要的作用和意义。水稻叶片产生适度的卷曲有利于其保持直立的姿态,同时也能减少叶片间的相互遮挡,提高水稻对光照的利用效率。前期研究发现,在水稻中过表达LRRK1基因后,转基因株系的叶片产生了明显的正卷表型。对卷曲叶片进行横切面的切片,通过显微镜观察发现,转基因株系的叶片中泡状细胞的数量和大小远低于野生型,这是卷叶性状产生的直接原因,但
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水稻（Oryza sativa L.）是世界主要粮食作物之一,具有重要的作用和意义。水稻叶片产生适度的卷曲有利于其保持直立的姿态,同时也能减少叶片间的相互遮挡,提高水稻对光照的利用效率。前期研究发现,在水稻中过表达LRRK1基因后,转基因株系的叶片产生了明显的正卷表型。对卷曲叶片进行横切面的切片,通过显微镜观察发现,转基因株系的叶片中泡状细胞的数量和大小远低于野生型,这是卷叶性状产生的直接原因,但有关LRRK1调控泡状细胞的生长的机制尚不明确。本研究利用LRRK1过表达的水稻材料,通过免疫沉淀联合质谱分析（IP-MS）的方法,筛选和鉴定了LRRK1的互作蛋白,并对筛选得到的蛋白进行了功能分析,为解析LRRK1影响水稻叶片泡状细胞发育的机制提供一定的理论依据。具体研究结果如下:（1）通过体内IP-MS联用的方法鉴定到可能与水稻LRRK1互作的蛋白共91个,筛选到与卷叶性状调控相关的蛋白Os A7和OsGF14e。Os A7属于质膜H+-ATPase,也被称为质膜质子泵,与植物细胞p H的调节、细胞的伸长生长紧密相关;此外,OsGF14e是一个典型的14-3-3蛋白,它在植物细胞内的信号传导及植物的生长发育过程中起重要作用,也具有调节质膜质子泵活性的作用。推测这2个蛋白可能与泡状细胞的发育有关,将其作为本研究的研究对象。（2）从水稻叶片的总cDNA中克隆得到了Os A7和OsGF14e基因,并对它们进行了生物信息学分析。Os A7的CDS全长2 856 bp,Os A7由951个氨基酸组成,和拟南芥的质膜质子泵AHA2同属于Ⅱ家族,同源性为81.26%,亚细胞定位的分析显示Os A7主要定位在水稻细胞的质膜上;OsGF14e的CDS全长789 bp,OsGF14e由262个氨基酸组成,它和拟南芥At GF14ω同属于非ε组,同源性为80.23%,通过亚细胞定位发现OsGF14e主要在水稻细胞的细胞质中表达。（3）通过酵母双杂交、BiFC以及Pull down实验探究了LRRK1和OsGF14e及Os A7间的互作关系。分别构建了OsGF14e、LRRK1和Os A7的酵母双杂交载体、双分子荧光互补载体以及原核表达载体,进行了互作分析的实验,结果证明:OsGF14e能与卷叶调控蛋白LRRK1相互作用,OsGF14e也能与Os A7的C末端存在互作关系,但LRRK1和Os A7之间不存在直接的互作关系。（4）在水稻中过表达OsGF14e后,水稻叶片出现了不规则卷曲的表型。为验证OsGF14e和Os A7是否参与调节水稻的卷叶,构建了OsGF14e和Os A7的过表达载体,以及基于CRISPR/Cas9的基因编辑载体。以上植物表达载体均通过农杆菌介导的水稻转化法分别转入Kitaake品种水稻,获得了OsGF14e过表达的阳性植株。对过表达OsGF14e的阳性植株进行叶型的观察,发现其出现了不规则卷叶的表型,说明OsGF14e可能与LRRK1调控水稻卷叶的分子机制相关。综上所述,本课题利用质谱鉴定的方法找到了与LRRK1互作的蛋白OsGF14e,并通过体内外的实验验证了二者之间的互作关系,同时本研究发现OsGF14e与质膜H+-ATPase蛋白Os A7互作,大量研究表明,这种互作可能起到调节质膜H+-ATPase的活性的作用。对OsGF14e过表达植株进行表型观察发现其具叶片有不规则卷曲的表型。因此猜测,在水稻中过表达LRRK1后,大量的LRRK1与OsGF14e互作,间接影响了OsGF14e与Os A7间的互作,导致Os A7作为质膜质子泵的酶活性下降,抑制了泡状细胞的生长发育,使水稻叶片发生卷曲。本研究结果为揭示LRRK1调控水稻卷叶的分子机制提供了理论基础。
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