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猪是医学实验动物中除灵长类以外和人类进化关系最近的物种,猪的生理生化特征与人类极为相似,因此作为人疾病动物模型,猪比其它动物具有更大的优势。荣昌猪是我国唯一以白色为主的地方猪种,具有独特的黑眼膛毛色特征俗称“熊猫猪”。在荣昌猪纯繁后代中会出现少量全身白色(俗称洋眼)个体。且部分纯白荣昌猪还表现出虹膜变浅的特征,其角膜瞳孔外区域较普通的荣昌猪的棕色更浅,呈现浅蓝色等表型;本实验对本研究拟从荣昌猪的纯白毛色入手,对该家系黑素生成通路相关基因进行分析,为探讨荣昌猪全白毛色产生的遗传机理奠定基础。为下一步将其作为人类皮肤相关疾病动物模型,用于试验治疗、药物筛选等医学研究提供遗传学的理论基础。
本实验选择中国地方猪种荣昌猪的正常和白化变异个体作为两种对照类型,展开对比性研究。主要工作内容包括:对两种类型猪眼圈周围皮肤进行石蜡切片观察和对两种类型猪虹膜进行投射电镜分析以明确其组织学差异性;采用荧光定量PCR技术(SYBR.GreenⅠ法),检测两种类型荣昌猪眼圈周围皮肤的色素生成通路中TYR、TRP-1、DCT、MITDF、LEF-1、KIT、KITLG、β-PKC基因mRNA的相对表达量,以寻找差异表达基因:对TYR、TRP-1、DCT的上游调控基因MITF、SLUG进行克隆测序比对,以寻找MITF和SLUG基因CDS区的核苷酸序列变异情况。
(1)在正常荣昌猪的眼圈周围皮肤组织中可以观察到大量黑色素,而白化个体眼皮肤组织中几乎没有。在正常荣昌猪和白化荣昌猪的虹膜中均检测到黑素小体的存在。
(2)发现正常荣昌猪眼圈周围皮肤中TYR基因的表达量显著高于白化荣昌猪(P＜0.05),TYRP-1、DCT基因的表达量极显著高于白化荣昌猪(P＜0.01)。
(3)对MITF、SLUG基因进行CDS序列克隆分析比对,没有发现正常与白化荣昌猪间存在核酸序列突变。
本研究发现黑素生成的关键酶类TYR、TYRP-1和DCT编码基因在转录水平的低表达是导致突变体荣昌猪黑素生成障碍,进而发生白化病理表型的直接原因,但未发现相应三个基因的上游调控基因MITF、SLUG存在序列突变,提示突变有可能存在于调控区域或其他相关基因内。研究结果可为进一步探讨荣昌猪中的一类特殊群体一纯白毛色家系为代表的中国地方猪种毛(肤)色分子调控的独特方式提供有力的分子生物学理论支持。