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5’-肌苷酸作为新一代增味剂的重要组成成份,在调味品行业占据了十分重要的地位,此外,在奶粉、饲料和保健品行业中,其作为功能型添加剂的应用也十分广泛。20世纪初,日本科学家开始了发酵生产5’-肌苷酸的研究,但目前为止,5’-肌苷酸发酵生产仍存在发酵周期过长,工艺控制过程十分复杂等缺点。本文以酸性磷酸酶(Acid phosphotranferase, AP/PTase)为研究对象,通过构建大肠杆菌及枯草芽孢杆菌重组菌,对5’-肌苷酸二步发酵工艺进行研究；并以构建的大肠杆菌重组菌为出发菌,对其发酵工艺,催化工艺进行了初步探究,为5’-肌苷酸新生产方法的应用奠定了基础。本文研究了以基因序列phoCY及突变序列phoCYM分别编码的AP/PTase及AP/PTaseM催化生产5’-肌苷酸的最适条件,并验证了二者催化能力,发现二者最适pH分别为pH 4.5和pH 5.2,最适温度均为35℃。AP/PTaseM催化能力为AP/PTase的3.05倍。在此条件下,探究了多种金属离子及表面活性剂对AP/PTaseM的影响,结果表明在5-10mmol/L范围内,Mg2+、Mn2+、Fe2+、Zn2+对AP/PTaseM酶活有促进作用,但在高浓度环境中,酶活受到强烈抑制；此外,表面活性剂对酶促反应有明显促进作用,当添加8.0%Tween60或5.0%Triton X-100时,转化率分别提高49.98%和40.57%。接着,以大肠杆菌重组菌XL1-Blue+pQE30-phoCYM为出发菌株,利用5L发酵罐确定了一种获得高酶活的细胞发酵工艺。诱导剂最适添加时机为对数前期(OD600=2.0～2.5),32℃持续诱导培养8 h,酶活达到最高,为1980.07 U/L。在此条件下,催化8h底物最适浓度分别为肌苷120 mmol/L,十水合焦磷酸钠200 mmol/L,转化率达99.32%.由于目前肌苷发酵生产技术已十分成熟,本文进一步提出了二步法生产5’-肌苷酸,即与肌苷发酵相偶联,在肌苷发酵液中催化生产5’-肌苷酸,设计出两种方案：1、以肌苷生产菌B. subtilis JG为出发菌株,利用穿梭质粒pBE43和pBSA43,构建了两株能够表达AP/PTaseM的重组菌B. subtilis JAB及B. subtilis JAF,进行二步法摇瓶发酵培养和催化反应,二者5’-肌苷酸产量分别为2.35g/L、2.96g/L。2、以XL1-全细胞催化B. subtilis JG肌苷发酵液。初步探究了发酵液处理方式及EDTA添加量,Tween 60对转化率的影响。结果表明对发酵液进行离心或煮沸处理可使转化率提高7.2%,达48.0%。加入60 mmol/L EDTA和8.0% Tween60可使转化率达61.62%,5’-肌苷酸含量为16.03g/L,提高了33.3%。