奶牛乳腺上皮细胞是唯一的乳腺分泌型细胞,其数量和活力决定了乳的产量和品质。体外培养的奶牛乳腺上皮细胞组成单一,脱离了在体复杂环境的干扰,是研究乳腺发育和泌乳机制、乳腺生物反应器的有效细胞模型。目前,还没有国际公认的永生化奶牛乳腺上皮细胞系,因此,建立稳定有效的奶牛乳腺上皮细胞系这项研究工作一直在延续。本研究中,奶牛乳腺上皮细胞的永生化及鉴定工作分为4部分：1.原代奶牛乳腺上皮细胞的永生化。在以往的研究中,作者已建立一套原代奶牛乳腺上皮细胞体外培养体系。在本研究中,以此原代细胞培养体系为基础,采用携带SV40大T抗原基因的逆转录病毒感染原代奶牛乳腺上皮细胞,获得4株永生化的奶牛乳腺上皮细胞系。经过传代培养,最终得到一株传代超过50代的永生化奶牛乳腺上皮细胞系,命名为CMEC-H;2.永生化细胞的生物学鉴定。对永生化的奶牛乳腺上皮细胞系CMEC-H进行端粒酶活性检测,20代的CMEC-H的端粒酶活性水平与293细胞水平一致,说明SV40大T抗原基因的插入使原代奶牛乳腺上皮细胞成功永生化；永生化的CMEC-H保持了原代细胞的形态特征,呈鹅卵石样；细胞增殖速率加快,细胞倍增时间约为36h,且不同代数细胞之间没有显著差异；CMEC-H细胞染色体数目增加为100条,远多于正常原代细胞的60条30对,这是由于基因插入后所导致遗传信息的改变；CMEC-H不会使裸鼠致瘤,说明永生化的细胞未癌变；3.永生化细胞特征性蛋白表达检测。采用细胞免疫化学检测特征性蛋白的原位表达以鉴定细胞的类型。人乳腺癌细胞MCF-7作为对照,表现为上皮特征性角蛋白CK7.CK8.CK18和CK19表达阳性,分化间质细胞特征性蛋白α-SMA阳性和间质细胞特征性蛋白Vimentin阴性表达,这一结果与前人研究报道一致；永生化的CMEC-H表现为上皮细胞特征性蛋白CK7、CK8和CK18以及Vimentin阳性表达,但α-SMA抗体阴性；同时,永生化使得干细胞标志性蛋白p63和CD44的强阳性表达；在正常培养条件下,永生化的CMEC-H具有上皮干／祖细胞特征,CMEC-H具有强的增殖能力,并且能够被诱导分化；4.永生化细胞的诱导分化。泌乳激素能够诱导永生化奶牛乳腺上皮细胞CMEC-H的诱导分化。采用qRT-PCR检测乳蛋白合成基因和脂肪酸合成相关基因的表达,结果显示,与原代细胞相比,αS1-酪蛋白(CSN1S1)、αs2-酪蛋白(CSN1S2)、和β-酪蛋白(CSN2)在永生化细胞CMEC-H不同代数中的转录水平尽管有变化,但差异不显著；但K-酪蛋白(CSN3)在CMEC-H中的表达显著上调；嗜乳脂蛋白(BTN1A1)、乙酰辅酶A羧化酶(ACACA)和脂肪酸合成酶(FASN)基因表达显著下调,过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARG)基因的表达显著上调；但定量PCR产物进行琼脂糖电泳结果显示,各样品之间没有明显差异。采用Western-Blotting技术检测了原代细胞,永生化第5、20和50代细胞的乳蛋白合成。以β-Actin为内参,结果显示4个样品都能检测到αS1-酪蛋白、β-酪蛋白、K-酪蛋白和嗜乳脂蛋白的合成,且原代细胞和永生化细胞的乳蛋白合成能力没有明显差异。基因和蛋白检测结果表明,奶牛乳腺上皮细胞经过永生化后,在细胞泌乳功能方面,一些关键基因的表达发生了变化,但对乳蛋白的合成没有影响,CMEC-H能够作为细胞模型用于乳腺生理机制的研究。总之,本研究中建立的永生化奶牛乳腺上皮细胞系CMEC-H具有自身更新能力,并且能够被诱导分化,是研究乳腺生理机制研究的理想模型。