牙种植术是目前修复牙齿缺失或牙列缺损的重要方法之一,种植体与牙周组织直接接触,缺少牙周膜样的结构作为缓冲,增加了种植体所受的力矩,使得种植体与骨之间结合欠佳或由于结合时间过久而导致种植手术的失败。目前已有许多文献报道了以干细胞为基础的组织工程再生技术能够有效恢复受损的牙周组织。牙周膜干细胞和颌骨间充质干细胞作为牙周再生的种子细胞,具有多向分化和自我更新的潜能,是牙周组织再生的关键。纯钛表面的纳米管形貌能够模拟自然的骨组织结构,因此从仿生学的角度来看纳米管结构具有较好的生物学活性。Ti O2纳米管形貌已经普遍用于多种细胞的研究中,包括成骨细胞、纤维细胞、软骨细胞、内皮细胞、肌肉细胞、表皮角化细胞和间充质干细胞等。而纳米管形貌对人来源的牙周膜干细胞和颌骨间充质干细胞的影响如何,目前还未见文献报道,因此本课题研究了钛表面纳米管形貌对这两种干细胞生物学行为的影响,为优化种植体的表面结构、促进种植体与牙周组织的结合,提供更加全面的理论指导。实验一Ti O2纳米管微观形貌的制备【目的】在钛表面构建不同管径的纳米管形貌,为后续实验提供研究模型。【方法】用不同粗度的砂纸将钛表面抛光至镜面,放置在含0.5%氢氟酸的电解液内,在三种电压下(5V、10V、20V)分别阳极氧化处理1 h,试样表面超声清洗后,采用场发射扫描电镜观察钛表面的纳米管形貌。【结果】钛表面经阳极氧化处理后形成排列整齐的均匀纳米管结构,纳米管直径大小与阳极氧化电压成正相关,在5V、10V、20V电压下分别形成25、50和90 nm的纳米管结构。【结论】阳极氧化能够在钛表面形成不同管径的均匀Ti O2纳米管形貌。实验二Ti O2纳米管对牙周膜干细胞成牙周组织的影响【目的】评价Ti O2纳米管形貌对牙周膜干细胞(PDLSCs)的形态变化、粘附行为、增殖能力及成牙周组织能力的影响。【方法】采用有限稀释法分离PDLSCs,将其接种于不同管径的纳米管表面,采用扫描电镜观察不同试样表面细胞的形态;用Hoechst染细胞核观察细胞的粘附;CCK-8试剂盒检测细胞的增殖水平;ALP试剂盒检测细胞的活性;天狼星红染色观察不同试样表面胶原的分泌;茜素红染色观察不同试样表面的胞外基质矿化;流式细胞仪检测细胞周期;实时定量PCR检测细胞在纳米管表面的基因水平。【结果】和Ti对照组相比,PDLSCs在不同管径的纳米管表面呈纺锤形生长,有许多的丝状和板状伪足,同时可以观察到纳米管形貌促进了PDLSCs的早期粘附;细胞周期检测结果显示,NT10和NT20轻微促进了PDLSCs的有丝分裂,而CCK-8的结果显示,纳米管形貌抑制了PDLSCs的增殖,这可能由于在细胞的增殖和分化中发生了拮抗反应,也可能是由于不同实验处理细胞的方法不同而产生的;纳米管形貌促进了PDLSCs的胶原分泌和Col-I、Col-III的基因表达;在未成骨诱导的条件下,纳米管形貌不能促进PDLSCs向成骨方向分化;在基因检测中,NT5促进了periostin和S100A4的表达上调。【结论】不同管径的纳米管形貌能诱导细胞形成不同的细胞骨架形态,纳米管形貌促进了PDLSCs的早期粘附和胶原分泌,并促进了相关基因的表达。实验三Ti O2纳米管对颌骨间充质干细胞生物学行为的影响【目的】评价Ti O2纳米管形貌对颌骨间充质干细胞(BMSCs)形态变化、粘附行为、增殖能力及成骨分化能力的影响。【方法】将BMSCs纯化后,接种于不同管径的纳米管表面,采用扫描电镜观察不同试样表面细胞的形态;用Hoechst染细胞核观察细胞的粘附;CCK-8试剂盒检测细胞的增殖水平;ALP试剂盒检测细胞的活性;天狼星红染色观察不同试样表面的胶原分泌;茜素红染色观察不同试样表面胞外基质矿化;实时定量PCR检测细胞在纳米管表面的基因水平。【结果】和Ti对照组相比,BMSCs在不同管径的纳米管表面伸展较快,有许多丝状和板状伪足伸出,同时可以观察到纳米管形貌促进了BMSCs早期的粘附,其中NT5和NT10的细胞粘附数量有显著性的差异;细胞增殖实验结果显示,NT5和NT10促进了BMSCs在其表面的增殖水平,结果显示BMSCs在小管径表面增殖的能力较为明显,随着纳米管直径的增加,细胞的增殖能力逐渐减弱;在成骨和未成骨诱导的条件下,NT20都促进了BMSCs在纳米管表面ALP的活性和胶原的分泌,且纳米管形貌也促进了Col-I和Col-III的基因表达;在未成骨诱导的条件下,纳米管形貌没有明显促进BMSCs向成骨方向分化;在成骨相关的基因表达中,NT20促进了ALP和RUNX2的表达上调。【结论】纳米管形貌促进了BMSCs的早期粘附,小管径的纳米管形貌促进了细胞增殖,大管径的纳米管形貌促进了细胞的ALP活性、胶原分泌和成骨基因的表达。实验四复合细胞膜片在Ti O2纳米管周围再生牙周组织的体内研究【目的】构建PDLSCs和BMSCs复合膜片,及其在Ti O2纳米管周围再生牙周组织的体内研究。【方法】采用有限稀释法获得人的PDLSCs和BMSCs;运用流式细胞术对两种干细胞的表面分子进行检测;克隆形成实验观察细胞的克隆能力;CCK-8试剂盒测定细胞的生长曲线;通过茜素红和油红染色观察干细胞向成骨和成脂方向分化的潜能;维生素C诱导两种干细胞形成细胞膜片;细胞膜片包裹Ti复合羟基磷灰石(HA)在体外培养1个月后检测牙周相关的基因表达;两种细胞膜片包裹不同管径的Ti O2纳米管放置于HA孔内,将其复合体植入裸鼠背部,8周后取材,进行硬组织切片和VG染色,评价复合体在裸鼠体内异位牙周再生的能力。【结果】通过有限稀释法分离获得了人的PDLSCs和BMSCs,两种细胞具有良好的克隆形成能力和增殖能力,通过流式细胞仪检测其表面分子,证明两种细胞均为间充质干细胞;通过茜素红和油红染色,证明两种干细胞具有向成骨和成脂方向分化的潜能;细胞膜片包裹Ti复合HA的基因检测结果显示Col-I、Col-III和S100A4的表达上调,虽然不是所有的纳米管形貌都促进了表达的上调,但依然可以表明纳米管形貌能够促进细胞膜片向牙周膜方向的分化;裸鼠体内实验结果表明,纳米管形貌能够促进复合膜片向牙周方向再生,其中在复合膜片/NT10/HA复合体表面有类似牙骨质样的结构形成,而没有支架材料HA包裹的细胞膜片,在裸鼠体内不能形成连续的形态结构,并且复合细胞膜片较单一来源的细胞膜片再生能力更强。【结论】有限稀释法分离培养的人PDLSCs和BMSCs具有多向分化和自我更新的潜能;纳米管形貌能够促进复合膜片在裸鼠体内的牙周异位再生。本课题创新点:1.首次将人来源的牙周膜干细胞和颌骨间充质干细胞应用在纳米管形貌上进行研究,明确了不同管径的纳米管形貌对两种干细胞生物学行为的影响。2.构建了不同来源的复合细胞膜片在纳米管周围牙周再生的模型,并对多种来源和单一来源的细胞膜片的包裹方式相比较,明确了不同来源的复合膜片的组织再生能力更强。3.通过裸鼠的体内实验明确了纳米管形貌能够促进牙周组织的再生,并且确定出NT10的纳米管形貌更接近天然的骨组织形态,为牙周再生提供了理论指导,并显示出一定的应用前景。