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目的建立Huh7肝癌干细胞的培养体系并研究雷公藤红素抑制Huh7肝癌干细胞的作用机制。方法1.通过悬浮传代培养的方法培养获得Huh7肝癌干细胞样细胞,并鉴定获得的肝癌干细胞样细胞具有肿瘤干细胞的特性。(1)用Hoechst33342和Rhodamine123染料分别染色经悬浮传代培养所得Huh7肝癌干细胞样细胞和普通的Huh7细胞,比较两种细胞对染料的外排能力。(2)用流式细胞仪检测经悬浮传代培养所得Huh7肝癌干细胞样细胞与普通Huh7细胞的细胞周期,比较两种细胞细胞周期的差异。(3)用Transwell体外侵袭实验比较经悬浮传代培养所得Huh7肝癌干细胞样细胞与普通Huh7细胞的侵袭能力,比较两种细胞侵袭能力的差异。(4)Western blot方法分别检测经悬浮传代培养所得Huh7肝癌干细胞样细胞与普通Huh7细胞干性蛋白的表达,比较两种细胞干性蛋白表达的差异。(5)裸鼠体内致瘤能力实验比较经悬浮传代培养所得Huh7肝癌干细胞样细胞与普通Huh7细胞致瘤能力的差异。2.雷公藤红素抑制Huh7肝癌干细胞的作用机制研究。(1)不同浓度的雷公藤红素分别处理Huh7细胞(16、8、4、2、1、0.5μM)和Huh7干细胞(32、16、8、4、2、1μM),CCK-8法分别于24h,48h,72h检测细胞活性。(2)0、1.5μM雷公藤红素分别处理Huh7细胞48h,流式细胞仪检测细胞周期。(3)不同浓度的雷公藤红素(0、1、2、4μM)分别处理Huh7细胞48h,流式细胞仪检测细胞凋亡。(4)不同浓度的雷公藤红素(0、1、2、4μM)分别处理第一代Huh7肝癌干细胞,72h后观察第一代Huh7肝癌干细胞的成球情况。(5)不同浓度的雷公藤红素(0、3、6、12μM)分别处理Huh7肝癌干细胞,48h后提取各处理组细胞蛋白,Western blot方法检测干性蛋白的表达。(6)不同浓度的雷公藤红素(0、3、6、12μM)分别处理Huh7肝癌干细胞,48h后提取各处理组细胞蛋白,Western blot方法检测Wnt/β-catenin信号通路上关键蛋白的表达。结果1.与普通肝癌Huh7细胞相比较(1)悬浮传代培养得到的Huh7肝癌干细胞样细胞对Hoechst33342和Rhodamine123染料不敏感。(2)悬浮传代培养得到的Huh7肝癌干细胞样细胞中处于G0期的细胞比例明显增多。(3)悬浮传代培养得到的Huh7肝癌干细胞样细胞具有更强的体外侵袭能力。(4)悬浮传代培养得到的Huh7肝癌干细胞样细胞干性蛋白的表达明显增多。(5)悬浮传代培养得到的Huh7肝癌干细胞样细胞裸鼠体内致瘤能力更强。2.(1)雷公藤红素可以明显的抑制Huh7细胞和Huh7干细胞的增殖,且呈明显的剂量依赖性和较明显的时间依赖性。(2)1.5μM的雷公藤红素可以明显的将Huh7细胞阻滞在S期。(3)雷公藤红素可以剂量依赖性的诱导Huh7细胞的凋亡。(4)雷公藤红素可以剂量依赖性的抑制第一代Huh7肝癌干细胞的成球。(5)雷公藤红素可以剂量依赖性的抑制干性蛋白Sox2、Klf4、Oct4的表达。(6)雷公藤红素通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的p-β-catenin、Cyclin D1蛋白抑制Huh7肝癌干细胞的增殖。结论1.悬浮传代培养所得Huh7肝癌干细胞样细胞有类似肿瘤干细胞的特性。2.雷公藤红素通过抑制Wnt/β-catenin信号通路抑制Huh7肝癌干细胞的增殖。