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前言:
铂类药物是目前最有效的抗癌药物之一，广泛应用于各种实体瘤的治疗。铂类药物的细胞毒作用主要是铂类与核蛋白连接，形成铂类药物与DNA链间或链内交联，以及DNA-protein交联损伤，DNA损伤信号可以通过促分裂原活化蛋白激酶、p53、Wnt等多种信号转导通路介导凋亡信号的激活，最终引起细胞凋亡或细胞周期抑制。然而，肿瘤细胞对铂类药物表现出耐药性的逐渐增强，影响了其临床应用。Wnt信号转导通路在肿瘤化疗耐药中起到重要作用，β-Catenin在Wnt信号转导通路中处于核心位置。C-myc基因是β-Catenin-TCF/LEF复合物的下游的靶基因，核内β-Catenin水平升高启动C-myc的高表达。C-myc基因具有刺激细胞增殖和诱导细胞凋亡的双重作用，其作用是通过调节细胞由G1期进入S期完成的。高水平的C-myc mRNA可增加细胞进入S期的速度。显然C-myc的过表达影响肿瘤细胞对顺铂的敏感性。本研究旨在探讨β-Catenin的下游靶基因C-myc是否参与了A549/DDP的顺铂耐药。
材料与方法:
1、试剂
小鼠抗人单克隆抗体β-Catenin(BD Biosciences，USA)、β-actin(Santa CruzBiotechnology，USA)、兔抗人单克隆抗体C-myc（碧云天生物技术研究所）、四甲基偶氮唑蓝(MTT)和顺铂(Sigma，USA);细胞培养用血清为HyClone胎牛血清（碧云天生物技术研究所）。
2、细胞培养
顺铂耐药肺腺癌细胞系株A549/DDP购自中国医学科学院肿瘤细胞库;A549细胞生长于10％胎牛血清的DMEM完全培养液,A549/DDP细胞生长于10％胎牛血清的1640完全培养液，细胞均培养于37℃、5％CO2培养箱中。
3、MTT细胞毒实验
96孔板中将接种处于对数生长期的A549和A549/DDP细胞(4000个/孔)，贴壁后加入梯度浓度的顺铂，37℃培养箱中继续培养48h，每孔加入20μg5mg/mL的MTT再孵育4h，弃去培养液，加入150μl DMSO溶解结晶，每个浓度重复三个复孔，酶标仪490/570nm双波长测定OD值，计算半数抑制浓度(Ic50值)。
4、Western blotting
提取A549和A549/DDP细胞总蛋白，电泳，转印，脱脂牛奶封闭，一抗β-Catenin(1∶800)，C-myc(1∶300)，β-actin(1∶500)4℃过夜，TTBS洗膜，山羊抗兔、山羊抗鼠二抗室温孵育2h，化学发光试剂盒显色，β-actin蛋白作为内参照以显示相同的上样量。
5、免疫荧光
24孔板培养细胞，0.4％多聚甲醛固定，0.2％TritonX-100打孔，一抗β-Catenin(1∶100)，C-myc(1∶100)4℃过夜，避光敷FITC标记二抗(1∶100)，DAPI染核，倒置显微镜下观察成像。
6、凋亡和周期
用不同浓度的的顺铂（0，5，10，20，30μg/ml）分别处理A549和A549/DDP细胞，收集对数期细胞后悬浮于结合缓冲夜中。细胞悬液中加入Annexin-V-FITC，避光加入碘化丙锭PI（终浓度为1μg/ml）混匀，凋亡细胞数用流式细胞仪测定。收集转染了C-myc siRNA48h的两株细胞约1×106/ml，预冷的PBS清洗，混匀入70％的乙醇中4℃过夜。避光下细胞重悬于碘化丙锭PI（终浓度50μg/ml）中，流式分析周期和凋亡。
7、转染
六孔板中接种A549和A549/DDP细胞(3x105个/孔)培养24h，按照说明指示用HiPerFect(QIAGEN，Valencia，CA)转染试剂及C-myc siRNA（上海吉玛公司合成）转染入已上两株细胞。将15μl C-myc siRNA与8μl HiPerFect转染试剂加入到200μl MEM中混匀孵育10min，A549、A549/DDP细胞分别重悬于1000μl的混有siRNA-HiPerFect转染试剂混合液、阴性对照单加HiPerFect转染试剂的DMEM及1640培养基中，培养48h。将20μM顺铂加入孔板中继续培养24h。经过以上72h，流式细胞仪检测凋亡和周期，细胞收集储存于-80℃以备蛋白质检测。
8、统计学分析
采用SPSS17.0软件进行统计分析，各组数据以均数士标准差（mean±s）表示，用t检验进行数据分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。
结果:
1、肺腺癌A549和A549/DDP细胞对顺铂的耐药性
MTT细胞毒实验结果显示顺铂对A549和A549/DDP细胞的IC50值分别为5.769±0.24μmol/L和28.373±0.96μmol/L，与A549细胞比较，A549/DDP的顺铂耐药性约是其5倍。
2、β-Catenin及C-myc蛋白在A549和A549/DDP细胞的表达
Western blotting结果显示β-Catenin及C-myc蛋白在A549/DDP细胞的表达较A549高(P＜0.05），顺铂作用48 h后A549细胞的β-catenin及C-myc表达较顺铂作用前下调，A549/DDP细胞的β-catenin及C-myc表达较顺铂作用前上调(P＜0.05)。
3、β-Catenin及C-myc基因在A549和A549/DDP细胞的免疫荧光定位免疫荧光定位结果显示顺铂作用48h后A549及A549/DDP细胞的β-Catenin由膜/浆/核表达转为浆/核表达，C-myc表达由浆/核表达转为核表达。
4、周期和凋亡分析
流式结果显示随着顺铂剂量的增加，细胞凋亡率成剂量依赖性增加。顺铂处理后A549、A549/DDP细胞S期减少，周期阻滞在G0/G1期。
5、C-myc siRNA对周期和凋亡及IC50的影响
A549/DDP中转染C-myc siRNA与NC和control组比较，C-myc siRNA组蛋白表达明显下降，凋亡率增加，周期S期细胞减少，G0/G1期增加，IC50值明显下降。说明C-myc siRNA可以提高A549/DDP细胞对顺铂的敏感性。
结论:
1、β-Catenin的下游靶基因C-myc在调节A549/DDP的耐药性中起到一定作用。
2、C-myc siRNA可以提高A549/DDP细胞对顺铂的敏感性。