论文部分内容阅读
目的和背景：目前，对于神经胶质瘤尤其是高度恶性的胶质母细胞瘤尚无较好的治疗方法。恶性脑胶质瘤化疗作为手术、放疗的补充近几年有所发展，然而，血脑屏障等脑组织结构的特殊性使之可选择的化疗药物较少，而且胶质瘤本身存在多重耐药，多方面的因素使得胶质瘤的化疗疗效低，对人类健康造成严重威胁，十分有必要探讨胶质瘤新的化疗药物及方案。环氧化物水解酶（solubleepoxide hydrolase, sEH）抑制剂通过抑制sEH活性稳定体内环氧二十碳三烯酸（epoxyeicosatrienoic acids, EETs）的含量，具有抗炎症、治疗高血压的作用。有研究表明，sEH抑制剂具有潜在的抑制肿瘤生长作用。本研究采用一种性能更优的新型sEH抑制剂t-AUCB，以胶质瘤母细胞瘤细胞系U251和U87作为研究对象，探讨t-AUCB对高度恶性胶质瘤细胞的生物学作用，探索sEH抑制剂可能存在的抗胶质瘤作用。方法和材料：(1) sEH抑制剂t-AUCB由美国加利福尼亚大学Davis分校的BruceD. Hammock教授惠赠，U251及U87细胞系由南京医科大学微生物与免疫学系姚堃教授惠赠。(2)利用sEH活性检测试剂盒，以Epoxy Fluor7作为sEH的底物，通过检测产物6-methoxy-2-naphthaldehyde的荧光度值来反应U251及U87细胞内sEH活性，并用同样方法检测t-AUCB对两种细胞内sEH活性的抑制作用。(3)用CCK-8法检测药物处理对细胞增殖的影响，并利用流式细胞仪检测药物处理对U251、U87细胞周期的影响以及对细胞凋亡的诱导情况。(4) RT-PCR法检测相关基因mRNA的表达情况，Western blot法检测相关蛋白的表达水平以及相关蛋白的磷酸化水平。(5)利用SPSS13.0软件分析数据，数据用均值±标准差来表示。P<0.05表示结果有差异。结果：(1) t-AUCB高效地抑制U251、U87细胞内sEH活性，10μM的t-AUCB对U251细胞内sEH活性的抑制率达86.3%，对U87细胞内sEH活性的抑制率达81.5%。(2) t-AUCB浓度达到100μM及更高时，能明显抑制U251及U87细胞的增殖。用200μM的t-AUCB处理细胞后，发现细胞内NF-κB-p65(Ser536)磷酸化水平明显增高。利用NF-κB抑制剂PDTC发现，抑制NF-κB活性后，t-AUCB对U251及U87细胞的生长抑制作用明显减弱，说明t-AUCB通过活化NF-κB-p65抑制U251及U87细胞的生长。(3) t-AUCB明显下调U251及U87细胞内Cyclin D1的mRNA和蛋白水平，并使细胞内CDC2的磷酸化水平明显降低。细胞周期检测发现t-AUCB能导致显著的G0/G1期阻滞，说明t-AUCB能通过调控Cyclin D1及CDC2导致细胞周期G0/G1期阻滞。(4)200μM的t-AUCB不引起U251和U87凋亡，说明U251和U87可能存在对t-AUCB诱导凋亡的抵抗。(5) t-AUCB处理后，U251和U87细胞内p38MAPK、MAPKAPK2及Hsp27的磷酸化水平明显增高，表明t-AUCB引起了p38MAPK-Hsp27途径的活化。利用p38MAPK特异性抑制剂SB203580和Hsp27抑制剂KRIBB3发现，抑制p38MAPK活性或者抑制Hsp27活化都能促使t-AUCB对U251及U87产生明显的诱导凋亡作用，说明U251和U87通过p38MAPK-Hsp27途径抵抗t-AUCB的诱导凋亡作用。结论：通过本研究我们发现，t-AUCB通过NF-κB-p65活化的途径抑制U251及U87细胞的生长，并通过调控Cyclin D1及CDC2导致细胞周期G0/G1期阻滞，对胶质瘤细胞的生长具有明显的抑制作用。我们还发现，U251和U87细胞通过p38MAPK-Hsp27途径抵抗t-AUCB的诱导凋亡作用，抑制p38MAPK活性或者抑制Hsp27活化能促进t-AUCB对U251及U87的诱导凋亡作用。因此，将t-AUCB和p38MAPK抑制剂或者Hsp27抑制剂联合应用将进一步增强t-AUCB的抗胶质瘤作用。