甲状腺癌是临床上常见的内分泌恶性肿瘤,也是目前发病率增长最快的恶性肿瘤,其中以甲状腺乳头状癌最为多见,可占甲状腺癌的80%~85%[1]。近年,甲状腺癌发病呈现全球激增的趋势,美国癌症学会(ACS)新近公布的报告数据显示,2001年~2013年间甲状腺癌的发病率上升了209%,且最近6年的增长率达到59%。据数据统计结果分析,美国2016年新发甲状腺癌病例数达64300例,占所有新发恶性肿瘤的3.8%,因甲状腺癌死亡的人数达1980例;而中国2015年的上述数据分别为90000例,2.1%和6800例[2]。尽管绝大多数甲状腺乳头状癌临床预后良好,经过手术、药物及放射性碘131治疗效果理想,但仍有一部分,大约10%的甲状腺癌表现出高侵袭性特征,如远处转移、容易复发,预后差,导致了这部分患者的死亡[3]。而且目前临床上对这部分甲状腺乳头状癌缺乏有效的甄别手段,临床处理仍比较棘手。因此,为解决面临的问题,就更需要我们研究其侵袭、转移的发生机制,寻找更多的分子标志物以便能早期筛选出具有高侵袭性特征的甲状腺乳头状癌,以评估其预后,进而为甲状腺乳头状癌的临床诊疗提供依据和参考。在本研究中,我们通过转录组基因测序探索甲状腺乳头状癌高危肿瘤和甲状腺乳头状癌低危肿瘤两组间差异表达基因,寻找与甲状腺乳头状癌发生及进展密切相关的基因,探讨相关基因在甲状腺乳头状癌中的表达、临床意义及其对甲状腺乳头状癌细胞的生物学功能的影响。第一部分基于转录组测序的甲状腺乳头状癌差异表达基因的筛选目的:通过新一代高通量测序技术对甲状腺乳头状癌组织标本行转录组测序,探寻甲状腺乳头状癌高危肿瘤和甲状腺乳头状癌低危肿瘤两组间的差异表达基因,以期揭示肿瘤发生发展过程中可能存在的分子机制,并为后续的机制研究提供全面的支持。方法:对样本(包含甲状腺乳头状癌高危肿瘤标本3例和甲状腺乳头状癌低危肿瘤标本3例)进行转录组测序,从甲状腺乳头状癌组织中抽提总RNA并构建文库,构建好的文库用Illumina Hiseq 4000进行测序,并对原始数据进行整理、过滤及质量评估,并通过对转录组测序结果进行参考基因组注释、差异基因GO/KEGG富集分析、聚类分析等,找出与甲状腺乳头状癌发生发展相关的关键基因。结果:(1)通过对甲状腺乳头状癌RNA-seq数据做生物信息学分析,研究发现了两组间共存在差异表达基因1892个,其中包括1403个上调基因和489个下调基因。(2)差异基因GO富集性分析结果反映在生物过程、细胞组分和分子功能3个方面。差异表达基因的生物过程功能分析显示主要富集在信号转导、小分子代谢过程、细胞黏附、转录调控和细胞外基质等方面;差异表达基因的细胞组分功能分析显示主要富集在细胞膜、膜整合、细胞质、胞外区、细胞核等方面;基因的分子功能分析显示主要富集在蛋白结合、金属离子结合部分。(3)差异表达基因的KEGG分析结果显示,较多差异表达基因参与肿瘤途径、灶性粘附、细胞因子受体作用和胞外基质受体作用等途径。(4)本研究筛选出部分表达量差异倍数较大且与肿瘤关系密切的基因,如ECM1,CCND2,PARP4,TNFRSF1B,PLK3,PROX1,LAMC2,SMAD9,CENPJ,STARD13,PIK3R1和MMP-9等。结论:该部分研究提供了高危甲状腺乳头状癌肿瘤和低危甲状腺乳头状肿瘤两组间的转录组测序结果,获得了差异表达基因,为甲状腺乳头状癌的进一步研究提供了潜在特异的分子标志物。第二部分PI3Kp85α在甲状腺乳头状癌中的表达及临床意义目的:根据转录组测序结果筛选出差异表达基因PIK3R1,验证其表达蛋白PI3Kp85α在甲状腺乳头状癌组织中的表达及其临床意义。方法:采用免疫组织化学法、Western blot和ELISA法检测116例甲状腺乳头状癌组织和癌旁正常甲状腺组织中PI3Kp85α蛋白的表达情况,并分析蛋白表达与患者性别、年龄、肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期和包膜侵犯等临床病理特征的关系。利用ROC曲线评价PI3Kp85α在甲状腺乳头状癌诊断中的价值。结果:PI3Kp85α蛋白的阳性表达率在甲状腺乳头状癌组织中显著高于癌旁正常甲状腺组织(69.8%vs 31.1%),两组间差异有统计学意义(P<0.01)。甲状腺乳头状癌中,PI3Kp85α蛋白表达水平在不同淋巴结转移、TNM分期和包膜侵犯方面存在显著差异(P<0.05)。PI3Kp85α曲线下面积(AUC)为0.966,当cut-off值取2.100时,诊断灵敏度(92.2%)和特异度(91.1%)较高。结论:与甲状腺正常组织相比,甲状腺癌组织中PI3Kp85α蛋白的阳性表达率明显升高,并与肿瘤淋巴结转移、临床分期和包膜侵犯密切相关,提示PI3Kp85α可能促进了甲状腺乳头状癌的浸润及转移。早期联合检测PI3Kp85α的表达可以作为甲状腺乳头状癌患者诊断和判断预后的指标之一。第三部分PI3Kp85α对甲状腺乳头状癌细胞生物学行为的影响及其作用机制研究目的:探索PI3Kp85α蛋白对甲状腺乳头状癌细胞TPC-1细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡等生物学行为的影响,并探究PI3Kp85α调控TPC-1细胞生物学行为的可能机制。方法:应用si RNA干扰技术抑制TPC-1细胞PI3Kp85α蛋白表达,荧光显微镜下观察转染效果,real-time PCR(RT-PCR)及Western blot检测干扰组(si RNA组)、阴性对照组(CONTROL组)和空白组(NC组)细胞PI3Kp85α表达水平。应用MTT比色法、平板克隆形成实验观察细胞的生长增殖能力;应用划痕愈合实验、Transwell迁移实验观察细胞的迁移能力;应用Transwell侵袭实验观察转染后细胞的侵袭能力;应用Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测细胞凋亡率,并应用Western blot和RT-PCR法检测转染前后细胞p-Akt、p-m TOR、p-S6K1和Bad等基因的表达变化情况。结果:1.成功将si RNA转染TPC-1细胞,荧光显微镜下观察,绿色荧光见于视野中80%以上的细胞;RT-PCR及Western blot结果示在si RNA组PI3Kp85α表达量明显低于CONTROL组及NC组,差异有统计学意义(P<0.05);CONTROL组及NC组两者间差异无统计学意义(P>0.05),证实si RNA转染成功。2.平板克隆形成实验结果示,与CONTROL组及NC组比较,si RNA组克隆集落形数目最少,差异有统计学意义(P<0.01)。MTT实验结果显示,si RAN组TPC-1细胞的半数抑制浓度(IC50)值最小,明显低于CONTROL组和NC组,并且随着研究观察时间的延长越加明显(P<0.05);CONTROL组和NC组相比较,差异无统计学意义(P>0.05)。3.Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测的NC组、CONTROL组及si RNA三组细胞的凋亡率分别为2.15±0.53%、2.61±0.36%和19.28±0.79%,si RAN组细胞凋亡率明显高于其他两组(P<0.01);NC组和CONTROL组凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)。4.si RNA组细胞的迁移能力显著降低。单层细胞划痕实验表明,CONTROL组及NC组的划痕距离显著缩小,而si RNA组细胞的划痕距离明显宽于CONTROL及NC组(P<0.01)。Transwell迁移实验结果表明,与CONTROL及NC组相比,si RNA组穿过微孔膜下层的细胞数明显减少(P<0.01)。5.PI3Kp85α表达水平对TPC-1细胞的侵袭能力存在明显影响。Transwell侵袭实验结果表明,与CONTROL及NC组相比,si RNA组穿过微孔膜下层的细胞数明显减少(P<0.01)。6.RT-PCR结果显示,si RNA组细胞p-Akt、p-m TOR和p-S6K1 m RNA水平明显低于CONTROL和NC组,而Bad则显著高于其它两组,P<0.01。Western blot检测结果显示,si RNA组与CONTROL和NC组相比,p-Akt、p-m TOR、p-S6K1蛋白明显减弱,Bad蛋白明显增强,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论:PI3Kp85α可促进甲状腺乳头状癌TPC-1细胞的增殖、迁移能力和侵袭能力,并抑制细胞凋亡。分子机制研究表明PI3Kp85α可能通过调控PI3K/Akt/m TOR/S6K1、PI3K/Akt/Bad信号通路影响TPC-1细胞的生物学行为。