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隐孢子虫是引起人类和家畜腹泻的主要病因之一。在免疫正常个体中隐孢子虫感染可造成长达3周的腹泻,但在免疫功能低下个体中可造成危及生命的消瘦和营养不良;隐孢子虫感染导致动物生产性能下降甚至死亡。研究表明,miRNAs在转录后水平调控防御隐孢子虫感染的先天性免疫反应中发挥重要功能。课题组前期研究显示,微小隐孢子虫感染HCT-8细胞后miR-942在12h表达显著上调,推测参与细胞的早期抗凋亡过程。先前,课题组采用q PCR、Western blotting等技术方法对微小隐孢子虫诱导miR-942表达上调通过TLR2/TLR4-NF-κB信号通路进行了验证。本研究使用siRNA技术进一步验证微小隐孢子虫诱导miR-942表达上调通过该信号通路,同时对HCT-8细胞miR-942靶基因进行了鉴定。分别设计了3条TLR2和TLR4 siRNA序列,通过细胞转染挑选抑制效果最强的siRNA。使用的序列分别是TLR2:GGAAGAUAAUGAACACCAATT(正义链)和UUGGUGUUC AUUAUCUUCCTT(反义链);TLR4:CCAGGUGCAUUUAAAGAAATT(正义链)和UUG GUGUUCAUUAUCUUCCTT(反义链)。将挑选出的siRNA通过细胞转染特异性抑制HCT-8细胞TLR2和TLR4的表达,在微小隐孢子虫感染0h、4h、8h、12h、24h和48h后提取总RNA,通过q PCR等方法,研究TLRs对miR-942表达的影响。结果表明,在隐孢子感染细胞后4h和8h miR-942表达显著上调(P<0.001)。使用TLR2 siRNA和TLR4 siRNA沉默TLR2和TLR4表达后,与对照组相比,在对应的时间miR-942的表达上调被显著抑制(P<0.001)。这些结果表明HCT-8细胞通过TLR2和TLR4启动由微小隐孢子虫所诱导的miR-942基因上调表达。通过生物信息学软件预测miR-942的潜在靶基因,结合靶蛋白是否在肠系细胞表达以及靶蛋白可能的生物学功能,分析发现miR-942靶蛋白中干扰素α诱导蛋白27(IFI27)与凋亡相关。本研究设计合成含有预测与miR-942存在互补结合位点及结合位点突变后的序列,将合成的两条基因克隆到双荧光素酶报告载体,构建了含有IFI27 3’-UTR及结合位点处突变的双荧光素酶报告基因载体。使用转染试剂将miR-942模拟物和构建的双荧光素酶报告载体共转染HCT-8细胞,使用双荧光素酶检测试剂检测荧光活性。结果表明,构建的野生型及突变型双荧光素酶报告载体插入的序列大小和方向经鉴定均正确;荧光活性检测结果显示,miR-942组与阴性对照组相比,转染空的双荧光素酶报告载体和含有突变位点报告载体试验组中,没有显示荧光素酶活性有显著的变化;转染含有结合位点载体的试验组中,miR-942组荧光素酶活性明显下降,差异具有显著性(P<0.05)。通过过表达和降低miR-942的表达量,发现过表达miR-942能降低干扰素α诱导蛋白27的蛋白水平,降低miR-942的表达量干扰素α诱导蛋白27的蛋白水平则升高,但过表达和降低miR-942的表达量对干扰素α诱导蛋白27的m RNA并没显著的影响。综上所述,微小隐孢子虫感染细胞后可通过TLR2和TLR4信号通路上调miR-942的表达。IFI27是miR-942的靶基因,且miR-942结合在IFI27 m RNA的3’-UTR区域。在转录后水平,miR-942通过非降解m RNA的方式抑制IFI27蛋白的表达。