目的：多发性硬化是中枢神经系统自身免疫性脱髓鞘疾病,是中青年神经致残的重要原因。该病发病机制复杂、尚未阐明,现有观点认为环境因素和遗传易感性共同参与了疾病的发生发展。多发性硬化病理学特征是炎性细胞浸润、髓鞘脱失和继发轴索损伤。鉴于目前尚无有效治疗手段,深入探讨多发性硬化的发病机制将有助于发掘潜在台疗靶点。实验性自身免疫性脑脊髓炎EAE是多发性硬化的动物模型,具有与多发性硬化类似的进展性神经功能缺损和典型病理特征。目前所有多发性硬化的疾病修正治疗手段均对EAE有效,其中一些药物就来源于对EAE的研究,这印证了EAE对多发性硬化高度的模拟度。抗原特异性T细胞诱导的免疫炎症是多发性硬化发生发展的最重要因素。Thl细胞和Th17细胞均是多发性硬化的参与者,而抗原持异性Th17细胞则是经典EAE的主要推动者。CD4+T细胞引发中枢神经系统炎性级联反应,其他免疫细胞和固有细胞产生氧自由基等毒性物质攻击少突胶质细胞。少突胶质细胞-髓鞘-轴索单位损伤造成神经信号传导障碍,继而引起多发性硬化的神经功能缺损症状。氧化立激参与多发性硬化的发生发展。氧化应激产生大量活性氧簇,消耗为源性抗氧化酶。高浓度氧自由基能够破坏血脑屏障、促进白细胞迁移、介导髓鞘脱失和轴索损伤。氧化应激还能够通过激活多种信号通路加重自身免疫炎症。但在众多途径中何种通路发挥关键性作用尚不明确。发病机制的研究一度给药物研发带来希望,但无论是免疫调节治序还是抗氧化治疗均未显示出理想效果。另外,多发性硬化中免疫炎症和氧化应激的相互作用机制尚不清楚,氧化应激通过何种具体途径参与炎症损伤仍待探究。新药研发的困境更凸显机制研究的迫切性。节者,对Th17细胞发挥免疫功能至关重要。近年来一系列研究凸显该通路在多发性硬化及EAE发病中占据重要地位,深入探讨p38MAPK-SGK1通路作用机制可能会为多发性硬化的治疗研究带来新思路。在脱髓鞘疾病中,p38MAPK既能够被氧化应激激活又在Th17炎症反应中发挥重要调节作用,故推测p38MAPK-SGK1通路是免疫炎症和氧化应激的关联枢纽,氧化应激通过p38MAPK-SGK1途径参与免疫炎症。本研究旨在通过干预剂对比研究,证实氧化应激-p38MAPK-SGK1致病通路在EAE发病机制中占据核心地位。此外,既往研究发现去甲二氢愈创木酸(nordihydroguaiaretic acid, NDGA)能够通过抑制氧化应激减轻自身免疫炎症,有效治疗EAE。本实验希望探讨其疗效是否部分来源于对氧化应激-p38MAPK-SGK1改病通路的抑制。方法：1 EAE模型建立将抗原MOG35-55用生理盐水稀释成10mg/ml,并按1：1等体积加入完全弗氏佐剂(其中结核杆菌H37Ra终浓度为4mg/ml)混合。乳化后以每只250ug/0.1ml于小鼠脊柱两侧分四点进行皮下注射,免疫当天(即第0h)及第2天(即48h)分两次腹腔注射05ml PTX(500ng/只上述免疫过程在乙醚麻醉及充分固定下进行。2 EAE神经功能评分和干预建立EAE模型后分别用SB203580、Tempol和NDGA干预EAE小鼠。自免疫后第1天开始,SB203580组小鼠SB203580 5mg/kg, TEMPOL组小鼠TEMPOL 25mg/kg, NDGA组小鼠每日腹腔注射NDGA 10mg/kg,空白对照组及EAE组小鼠每日腹腔注射等量的生理盐水。神经功能评分采用国际通用的VWerver (15分)评分标准：尾部-0分：无症状；1分：尾部张力减低或远端瘫；2分：全瘫。肢体——0分：无症状；1分：步态笨拙；2分：轻瘫,拖曳；3分：全瘫,外翻。根据尾部和每个肢体情况累加计分。15分为濒死。3组织病理学观察小鼠经水合氯醛麻醉后,4%多聚甲醛灌流,取脊髓腰骶段石蜡包埋,5μm连续切片。在光镜下,通过HE染色观察小鼠脊髓腰膨大处炎性细胞浸润,每只小鼠取3张脊髓组织切片,对每张脊髓切片选取5个高倍(400)视野进行炎性浸润情况评分,计算每只小鼠平均炎性评分。HE染色炎症评分标准：0分,无炎性细胞浸润；1分,散在炎性细胞浸润；2分,血管周围炎性细胞浸润；3分,“血管套袖”形成并累及周围组织。通过LFB染色观察小鼠脊髓腰膨大处髓鞘脱失情况,每只小鼠取3张脊髓组织切片,对每张脊髓切片选取5个高倍(400)视野进行髓鞘脱失情况评分,计算每只小鼠平均髓鞘脱失评分。LFB评分标准：0分,无髓鞘脱失；1分,稀少的髓鞘脱失；2分,多发的髓鞘脱失；3分,大片状、融合的髓鞘脱失。用免疫组织化学染色方法观察小鼠脊髓p38、p-p38、SGK1、 IL-17、RORγt和HO-1表达。将染色后的脊髓组织切片于光学显微镜下进行观察,阳性细胞：可见棕黄颗粒；阴性细胞：无棕黄颗粒。每只小鼠选择3张组织片,每张组织片随机选取5个高倍视野在10×40陪光学显微镜下进行观察,对细胞核完整的免疫阳性细胞进行计数,计算出每组小鼠每个时间点的阳性细胞个数的平均值。自对照组和干预组各取材1只小鼠,用2.5%戊二醛灌注固定半小时以后,取脊髓保存于4%戊二醛电镜保存液中数天,取脊髓后索部位用新鲜刀片切成1mm正方形小块,经过饿酸固定,梯度脱水,包埋剂浸透包埋,修块,切片等过程后制成切片在透射电镜下定性观察髓鞘和轴索的形态学变化。4Western blot去检测p38MAPK、p-p38MAPK、SGK1、IL-17、 OROγt和HO-1从脊髓细胞中提取总蛋白,BCA法检测蛋白浓度。根据蛋白浓度上样,之后电泳,浓缩胶：80V；分离胶：100V，直到所需marker条带跑完后停止电泳。电泳结束后,使用转移电泳装置,在4℃,100V恒玉条件下电转120min,将蛋白转移到PVDF膜上。用封闭液(含5%脱脂牛奶的TBST溶液)室温封闭PVDF膜1小时。一抗孵育：封闭液稀释抗体,然后与封闭好的PVDF膜4℃过夜。二抗孵育：用封闭液稀释相应的二抗,室温下孵育PVDF膜。将膜经凝胶成像仪成像,用软件image J测得得出各标本目的蛋白即p38MAPK、p-p38MAPK、 IL-17、RORγt和HO-1条带灰度相对值及对应内参的灰度值,两者相北,算得比值。5MDA检测方法检测各种小鼠脊髓MDA含量,以评估组织氧化应激水平。采用硫代巴比妥酸(TBA)法,利用多功能酶标仪SynergyHT型于波长532nm处测定,含量单位为nmol/mgprot.测定原理为过氧化脂质降解产物中的丙二醛(MDA)可与硫代巴比妥酸(TBA)缩合,从而形成红色产物,在532nm处有最大吸收峰。6 RT-PCR检测p38MAPK、SGK1、NFAT5和HO-1mRNA表达情况首先从脊髓细胞中提取总RNA,鉴定RNA纯度和浓度。应用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。之后采用sybr green法检测扩增变化。采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。计算方法是：目的基因相对表达倍数=2-△△C(t),c(t)值是热循环仪中荧光达到荧光阈值的循环数,根据△c(t)实验组=C(t)目的基因-c(t)ACTIN,△c(t)对照组=c(t)目的基因-c(t)ACTIN,△△c(t)=Δc(t)实验组-△c(t)对照组,对每一标本计算目的基因相对于对照组基因的相对定量结果。即其他各个样品相对于对照样品,目的基因mRNA转录水平的差异。7统计方法采用SPSS19.0统计软件进行统计分析。实验所测得数据进行正态性检验和方差齐性检验,以“均数±标准差”表示。发病率用用卡方检捡进行统计学分析,以百分比表示。多组计量资料均数的比较：方差齐时应用ONE-WAY-ANOVA中SNK-q检验进行方差分析,方差不齐时立用非参数秩和检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。结果：1本研究观察了EAE发病过程中免疫炎症、氧化应激和)38MAPK-SGK1通路的动态变化。发现随着EAE进展,小鼠中枢神经系统病理损伤加重,Th17细胞增多,p38MAPK-SGK1通路因子表p38MAPK-SGK1通路还是氧化应激水平的动态变化,都呈现出与EAE临床病程的一致性,提示在中枢神经系统自身免疫炎症中二者可能存在较强关联。2应用p38MAPK抑制剂SB203580和抗氧化剂Tempol干预EAE小鼠,均显示出良好的治疗效果。干预组与EAE对照组相比,发病率降低,发病时间和症状达峰时间延迟,病程各时期神经功能损伤程度减轻。病理损伤方面,小鼠发病各时期中枢神经系统炎性浸润程度降低、髓鞘脱失区域缩小、轴索损伤减轻。免疫组化检测和Western)1ot均显示IL-17和RORγt表达降低,提示Th17炎症反应削弱。此外,抗氧化治疗展现出对p38MAPK-SGK1通路的强烈抑制作用,显示氧化应激是p38MAPK-SGK1通路的重要上游刺激物。氧化应激p38MAPK-SGK1致病通路在EAE发病机制中占据核心地位。3通过EAE评分、组织病理学观察以及对IL-17和RORγt勺蛋白含量检测,本研究发现NDGA成功改善了EAE临床症状和病理损防,削弱了中枢神经系统Th17炎症反应,显示出与SB203580和Tempol相同的良好治疗效果。在NDGA干预下,EAE小鼠脊髓MDA含量下降、HO-1表达升高,p-p38MAPK和SGK1含量明显降低,显示NDGA通过抗氧化和抑制p38MAPK炎性反应双重作用治疗EAE。结论：本实验应用MOG35-55免疫C57BL/6雌性小鼠成功建立EAE模型,印证了EAE炎性浸润、髓鞘脱失的病理特征,并发现EAE发病过程中,T细胞反应、氧化应激和p38MAPK-SGKl通路三者的动态变化呈现一致性。p38MAPK抑制剂SB203580和抗氧化剂Tempol干预各自成功改善了EAE临床症状和病理损伤,削弱了中枢神经系统Th17炎症反应,并显示出相同的作用效果,抗氧化治疗还展现出对p38MAPK-SGK1通路的强烈抑制作用。这不仅确证了EAE中p38MAPK通路和氧化应激各自的重要地位,更显示氧化应激通过p38MAPK-SGK1通路促进Th17细胞免疫应答,进而引发炎性浸润、髓鞘脱失等病理损伤,导致上升性弛缓性瘫等临床症状。氧化应激p38MAPK-SGK1致病通路在EAE发病机制中占据核心地位。去甲二氢愈创木酸(nordihydroguaiaretic acid, NDGA)具有抗氧化和抗炎性反应双重属性,在EAE中以氧化应激p38MAPK-SGK通路为靶点发挥多重保护作用,作为多发性硬化的潜在治疗药物,具有广阔研究前景。