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基因片段的变异与基因疾病的产生有密切的关系,其中单碱基多态性是最常见的遗传变异。单碱基多态性的精确、灵敏和特异性检测已经成为全社会关注的问题,并且有望在DNA诊断中起到至关重要的作用。蛋白质是一类重要的生物标志物,它的分析检测在生物学、医学诊断等领域具有非常重要的意义。本论文致力于单碱基多态性和蛋白质的检测新方法研究,完成了三项工作,实现了对目标物的快速、灵敏、准确检测。主要内容如下:
1.利用适配子-血红素的复合物能够模拟辣根过氧化酶的生物活性,催化鲁米诺和双氧水的化学发光反应的特性,提出了一种基于连接酶检测反应和等温扩增反应的化学发光检测方法,用于单碱基多态性的检测
【第2章】。对于完全匹配的杂交体,通过连接酶检测反应,产生大量的探针连接产物,但对于单碱基错配的杂交体,连接酶不起连接作用。连接产物由于在DNA聚合酶和限制性内切酶的共同作用下,发生等温扩增反应,扩增出大量的血红素的适配子,适配子与血红素结合,形成的复合物催化鲁米诺和双氧水的化学反应。在一定范围内,化学发光的强度与目标链浓度成正比,从而实现单碱基多态性的定量检测,检测下限达到1 pM.我们用该方法对细胞色素P450酶系中的异喹胍羟化酶的单碱基多态性(CYP2D6*10)进行了检测,使突变型和野生型基因DNA得到了很好的区分。
2.基于类似的原理,将上述方法改进发展,实现了单碱基多态性更灵敏、更快速的分析检测
【第3章】。分析过程包括两个并行合作的等温扩增反应,第一步等温扩增产生的核酸链可以作为第二步等温扩增的引物,引发第二步等温扩增,产生了大量的血红素的适配子,通过检测适配子-血红素复合物催化产生的化学发光的强度,定性定量检测单碱基多态性。
3.适配子传感技术与临近杂交、体外转录相结合,建立了一种新的蛋白质荧光检测方法
【第4章】。当溶液中没有凝血酶时,由于两条探针尾端的互补序列很短,所形成的杂交体的熔链温度很低,在反应温度下,极不稳定。然而当溶液中存在凝血酶的时候,适配子探针与凝血酶特异性结合,拉近了探针间的距离,使得探针能够杂交,聚合酶延伸产生启动序列,进而转录出孔雀石绿的适配子,适配子与孔雀石绿结合,使其荧光增强,从而实现对凝血酶的检测。