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背景与目的:anisomycin是一种能够抑制肽链延伸,阻滞蛋白合成的细菌源性小分子抗生素。文献报道和本课题组之前的研究均证实anisomycin体外能够抑制多种肿瘤细胞生长,诱导细胞凋亡,但其作用机制尚未明了,也未见anisomycin对肝脏肿瘤生物学行为的影响与机制的报道。肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是一种常见的恶性肿瘤,具有病情发展快、恶性度高和生存期短等特点。由于失代偿性肝硬化通常伴随着HCC的发生,临床上缺乏高效、低毒和靶向治疗的药物。炎症与肿瘤的发生、发展和转移密切相关,炎症小体信号在调控固有炎症性免疫应答与细胞死亡中发挥至关重要的作用。因此,探明HCC发生和发展的生物学机制以及干预路径,寻找有效的药物靶点具有极其重要的科学意义。本研究试图探明炎症小体NLRP3(NOD-like receptor family pyrin domain containing 3)和NLRP6(NOD-like receptor family pyrin domain containing 6)在anisomycin抗HCC中的作用及其机制,以期为临床治疗HCC提供新的策略和理论支持。方法:(1)anisomycin体外处理人源肝脏肿瘤细胞Hep3B及鼠源肝脏肿瘤细胞Hepa1-6,以人源正常肝脏细胞LO-2作为对照,检测anisomycin对这些细胞增殖、凋亡、粘附及迁移等生物学行为的影响;利用Western Blot检测NLRP3炎症小体和Wnt通路中关键分子的表达水平,ELISA检测细胞上清中炎症性细胞因子IL-1β和IL-18的分泌量,确定anisomycin对Wnt信号通路的影响以及与NLRP3炎症小体活性变化的关系;收集肝脏肿瘤病人临床样本,通过IHC、Western Blot和qPCR测定NLRP3在肿瘤组织与癌旁组织之间的差异表达,进一步明确其与肝脏肿瘤发生的关系;通过热漂移检测(Thermal drift detection,TSA)and)和表面等离子共振(Surface plasma resonance,SPR)技术确定anisomycin在HCC细胞膜上直接作用的分子;利用免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)与荧光能量共振转移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)确定关键分子过氧化物酶体增殖激活受体δ(Peroxisome proliferation activated receptors,PPARδ)、热休克蛋白90(Heat shock protein,HSP90)及NLRP3之间的相互作用关系,并通过相应的分子激动剂和抑制剂的干预以明确各分子间的上下游调控关系;最后建立小鼠荷瘤模型以确认anisomycin在体内抗肝脏肿瘤的效果,苏木素-伊红染色观察anisomycin体内注射60 d后小鼠重要生命脏器心、肝、脾和肾组织的病理学变化,并检测小鼠血清中ALT、AST、BUN和TNF-α的水平。(2)通过CD513B和GV298慢病毒载体分别构建人源NLRP6过表达和敲低的载体以及筛选后获得稳定表达的细胞株,探明NLRP6在anisomycin抗HCC中的作用;IHC检测正常肝脏组织及肝癌组织临床样本,进一步验证NLRP3和NLRP6的变化与临床HCC发生的关系;再分别干预NLRP6和Caspase-8以弄清其与NF-κB和NLRP3信号之间的联系。结果:anisomycin在体外能抑制HCC细胞的增殖,减弱细胞粘附力,抑制细胞迁移,促进其凋亡。TSA和SPR显示anisomycin直接作用于细胞膜受体分子Frizzled 3(FZD3)和FZD6。anisomycin抑制细胞内Wnt信号通路相关分子的表达,上调NLRP3炎症小体相关分子,并促进炎症性细胞因子IL-1β和IL-18的分泌。PPARδ在HCC组织中上调,而NLRP3却明显下调。Co-IP和FRET显示anisomycin能抑制HSP90与NLRP3之间的相互作用。体内试验表明anisomycin能通过激活NLRP3有效抑制HCC的生长,5.0–12.5 mg/kg剂量下未见明显损伤。有趣的是anisomycin引发NLRP3上调时NLRP6反而下调。NLRP6的过表达能够在一定程度上减弱anisomycin抗HCC的作用。Caspase-8能抑制NLRP6激活NF-κB信号,从而上调NLRP3。结论:anisomycin能够通过FZD6/Wnt/PPARδ/HSP90信号通路激活炎症小体NLRP3活性,促进HCC细胞凋亡,抑制HCC的生长。anisomycin也可通过Caspase-8抑制NLRP6激活NF-κB信号,从而抑制NLRP6对NLRP3的间接负反馈调节作用。