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病毒性疾病的危害已威胁到人类生存，在2006年3月由国际医学科学院组织召开的第二届全球大会上，500名专家指出：不断变化的病毒使全球处于大流行的危险之中。WHO等单位联合发布的《发展中国家疾病控制优先项目》中指出：人类卫生面临的四大挑战，其中第三项为新发病毒性疾病的大流行。
随着分子生物学理论和技术在病毒学研究中的应用，尽管现代医学对病毒感染机制的认识有了飞越性的发展，但控制手段始终没有突破性进展，寻找有效的控制病毒性疾病的手段已成为21世纪人类的重要事件。
中医药防治病毒性疾病有数千年的经验和完整的理论体系，是中医药治病的优势领域。以其疗效确切、相对广谱、低毒的特点已被世人所接受，医学界期待从中医药中发现控制病毒性疾病的有效药物。近20年来，虽然大量的试验证实了中药治疗病毒性疾病的有效，尤其是SARS以后国内外从中药中寻找有效的抗病毒成分成为热点，但直至目前抗病毒中药的研制并没有突破性进展。其原因①缺乏充分体现中医药治疗病毒性疾病特点的研究思路；②缺乏充分体现中医药治疗病毒性疾病特点的研究手段。因此，在中医药治疗病毒性疾病理论的指导下，应用现代生物学技术和手段研究中药治疗病毒性疾病的机理，对中药走向世界具有重要的现实意义。
本研究在原有抗病毒药效试验和抗病毒作用机理研究的基础上，从病毒吸附环节的一些非特异性病理生理环节入手，以2～3种病毒株为样本，进一步探讨病毒吸附细胞的生物学机制和中药栀子提取物ZG和半枝莲总黄酮对此环节的干预作用，为寻找中药抗病毒作用的真正靶点奠定基础。本论文的研究内容为国家自然科学基金面上项目资助课题的部分内容。
一、栀子提取物ZG及半枝莲总黄酮的体外抗病毒作用研究以Hep-2细胞株作为宿主细胞，以阿昔洛韦作为抗单纯疱疹病毒1型的阳性对照药，采用致细胞病变法(cytopathiceffectCPE)来观察栀子提取物ZG和半枝莲总黄酮对4种病毒致细胞病变作用的影响，并按Reed-Muench方法计算最大无毒浓度(TC0)，50﹪细胞毒性浓度(TC50)，50﹪抑制浓度(IC50)和治疗指数(TI)。结果显示：栀子提取物ZG对Hep-2细胞的TC0和TC50分别为5mg·mL-1和12.74mg·mL-1；半枝莲总黄酮对Hep-2细胞的TC0和TC50分别为3.13mg·mL-1和8.91mg·mL-1；阿昔洛韦的TC0和TC50分别为0.2mg·mL-1和1.14mg·mL-1。栀子提取物ZG和半枝莲总黄酮均对单纯疱疹病毒1型(HSV-1)和副流感病毒1型(PIV-1)所引起的细胞病变有明显抑制作用，半枝莲总黄酮对呼吸道合胞病毒(RSV)有明显的抑制作用；两者对柯萨奇B族病毒4型(CoxB4)均无明显抑制作用。其中，栀子提取物ZG对HSV-1的IC50为0.45mg·mL-1，TI为28.31；对PIV-1的IC50为1.00mg·mL-1，TI为12.68。半枝莲总黄酮对HSV-1的IC50为1.28mg·mL-1，TI为6.96；对PIV-1的IC50为1.41mg·mL-1，TI为6.32；对RSV的IC50为0.68mg·mL-1，TI为13.10。阳性对照药阿昔洛韦对PIV-1的IC50和TI分别为0.05mg·mL-1和19.05。
二、病毒吸附对宿主细胞膜电位的变化及中药的干预作用运用细胞膜电位特异性荧光探针DiBAC4(3)标记Hep-2细胞膜电位，以流式细胞仪为检测手段，观察3种不同病毒(HSV-1，PIV-1，Ad-3)吸附过程中宿主细胞膜电位的变化情况；并以氯化乙酰胆碱为阳性对照，探讨中药栀子提取物ZG和半枝莲总黄酮对此过程的干预作用，为研究病毒吸附宿主细胞的生物学机制及中药对此环节的干预作用提供理论依据。结果显示：正常Hep-2细胞膜电位荧光值在静息状态下基本稳定在65-75范围内；2种中药对正常细胞膜电位基本无影响；HSV-1和PIV-1病毒吸附30min内，膜电位下降，处于超级化状态；2种中药均分别以3种加药方式作用后，对HSV-1和PIV-1吸附过程中Hep-2细胞膜电位的超极化状态均没有明显影响。结论：病毒吸附宿主细胞过程中使膜电位持续下降，处于超极化状态，从而有利于病毒的内化，可能为病毒感染的生物学机制之一。乙酰胆碱对病毒吸附过程中膜电位的下降有明显改善的作用，而栀子提取物ZG和半枝莲总黄酮对此无明显干预作用，说明中药抗病毒机理可能与此环节无关。
三、病毒吸附对宿主细胞膜Na+-K+-ATP酶活性的影响及中药的干预作用采用定磷法和分光光度计检测HSV-1和PIV-1吸附后Hep-2细胞膜上Na+-K+-ATP酶活性的变化，以探讨病毒吸附环节的生物学机制。同时设肝素钠为阳性对照药，观察中药栀子提取物ZG和半枝莲总黄酮在三种不同加药方式作用后，对HSV-1和PIV-1吸附后Na+-K+-ATP酶活性变化的干预作用。结果显示：HSV-1和PIV-1在吸附Hep-2细胞过程中，细胞膜Na+-K+-ATP酶活性均显著增加，与正常细胞组比较有显著性差异；栀子提取物ZG和半枝莲总黄酮在3种加药方式作用下，对HSV-1和PIV-1吸附后Na+-K+-ATP酶活性均有显著的升高趋势，但与病毒对照组比较均无显著性差异；肝素钠在3种加药方式作用下，对HSV-1吸附后Na+-K+-ATP酶活性均有降低的趋势，其中以先加药后病毒吸附组最为显著，但与病毒对照组比较均无显著性差异。结论：在HSV-1和PIV-1内化过程中，膜Na+-K+-ATP酶活性升高，说明在HSV-1和PIV-1感染细胞的过程中确实有能量的参与，病毒借助ATP水解产生的能量感染宿主细胞，但其具体的生物学机制有待进一步研究。中药栀子提取物ZG和半枝莲总黄酮在其有效剂量内，3种加药方式下，均有升高病毒吸附后宿主细胞膜Na+-K+-ATP酶活性的趋势，由于国内外目前未见该方面的研究和报道，中药对此环节可能的作用机制需要进一步研究。肝素钠具有封闭HSV-1配体的作用，可通过阻断HSV-1吸附来间接干预Na+-K+-ATP酶活性的升高；但与HSV-1对照组比较没有显著性差异提示与病毒量比较肝素钠用量可能相对不足。
四、病毒吸附对宿主细胞膜流动性的影响及中药的干预作用以往研究发现正常细胞膜具有良好的流动性，漂白后荧光恢复率为73.89﹪；HSV-1感染后Hep-2细胞膜流动性显著降低，荧光恢复率为18.54﹪；栀子提取物ZG3种用药方式作用下，均可明显改善HSV-1感染细胞膜的流动性。本研究中除进一步验证栀子提取物ZG对HSV-1吸附后Hep-2细胞膜流动性的影响外，同时又观察PIV-1吸附后细胞膜流动性的变化及半枝莲总黄酮对细胞膜流动性的影响。结果显示：正常细胞膜具有良好的流动性，荧光恢复率为72.66﹪；HSV-1和PIV-1吸附后Hep-2细胞膜流动性均显著降低，荧光恢复率分别为为26.73﹪和19.85﹪；栀子提取物ZG在3种不同用药方式作用下，均可明显改善HSV-1和PIV-1吸附后细胞膜的流动性，与病毒感染对照组比较均有显著性差别；在半枝莲总黄酮3种用药方式中，对HSV-1感染的影响，其中先用药处理后病毒吸附组和药物处理同时病毒吸附两组可明显改善细胞膜流动性，扩散系数和荧光恢复率均显著升高，并与病毒对照组比较有显著性差异；而先病毒吸附后药物作用组以及对PIV-1的3个不同用药组对细胞膜流动性均有一定的改善作用，扩散系数出现了升高的趋势，而荧光恢复率明显提高，与病毒对照组比较有显著性差异。结论：病毒吸附过程中，膜流动性下降，可能为病毒感染的生物学机制之一；通过改善细胞膜的流动性，从而维持细胞膜的正常功能可能是中药干预病毒吸附，从而达到抑制病毒病变的作用机制之一。