论文部分内容阅读
淀粉脱支酶能够专一、高效地切断支链淀粉中的分支点，可以加速后续酶的反应、提高淀粉的转化率，在淀粉加工工业中具有重要的应用价值。淀粉脱支酶分为普鲁兰酶（EC3.2.1.41）和异淀粉酶（EC3.2.1.68）。二者虽然均能水解α-1,6-葡萄糖苷键，但它们的底物特异性却有较大的差异。普鲁兰酶适宜作用于小分支底物，在葡萄糖的生产过程中具有重要作用，对其研究也最多；异淀粉酶对大分支底物水解活力高，研究较少。目前淀粉脱支酶的研究主要存在以下问题：大多数普鲁兰酶的热稳定性差和催化效率低；一些新的淀粉加工产品需要对大分支底物进行脱支，但是适用于该过程的异淀粉酶的研究偏少；此外，目前报道的淀粉脱支酶的发酵单位普遍偏低。本论文针对淀粉脱支酶研究中存在的上述问题，重组表达了来源于Bacillusderamificans普鲁兰酶编码基因pulA，并定向改造了酶的催化性能和热稳定性，通过优化发酵工艺和N端结构域切除提高了普鲁兰酶的可溶性表达水平和胞外分泌效率。此外，克隆表达了适用于大分支底物高效脱支的异淀粉酶，建立了异淀粉酶与α-CGTase协同作用制备环糊精的同步转化新工艺。主要研究结果如下：（1）普鲁兰酶的重组表达及酶学性质分析：构建了带有B. deramificans普鲁兰酶编码基因pulA的重组菌株BL21（DE3）（pET24-ompA/pulA），对重组酶进行了纯化和酶学性质分析，结果显示重组酶的最适pH为4.5，最适温度为55°C，半衰期为20h；重组酶对普鲁兰多糖、糊精（DE10）和可溶性淀粉具有较高的水解效率，对支链淀粉水解能力较差，不能水解糖原。动力学分析显示，普鲁兰酶以普鲁兰多糖为底物时的Vmax、Kcat、Km和Kcat/Km分别为469.7U mg-1、2109.0s-1、0.70mg mL-1和3012.8s-1mg-1mL。重组普鲁兰酶与糖化酶协同作用，反应52h，DX值达到92.7%，比对照提高了1.3%。（2）定点突变提高普鲁兰酶的热稳定性及催化效率：为了提高天然普鲁兰酶的热稳定性，采用基于序列比对以及蛋白模拟结构分析相结合的策略，分别对B.deramificans普鲁兰酶的437位和503位的氨基酸进行了突变，构建了4个普鲁兰酶突变体（D437H、D503F、D503Y和D437H/D503Y）。结果显示，4个突变体的热稳定性和催化效率都得到了提高。其中双突变D437H/D503Y的最适温度比对照提高了5°C，半衰期比对照提高了4.3倍以上。天然酶和D503Y在常温分别储存28d和45d后酶活力下降一半，D437H/D503Y储存270d后酶活力没有明显下降。动力学研究表明，D503Y和D437H/D503Y的Km值分别是天然酶的58.6%和54.3%，催化效率分别是天然酶的2.4倍和2.0倍。糖化复配应用结果显示，D503Y和D437H/D503Y的添加可以使糖化的DX值达到95.5%和95.0%，分别比天然酶提高了2.6%和2.1%。突变体D503Y和D437H/D503Y可以满足糖化过程对普鲁兰酶稳定性及催化效率的要求。（3）发酵条件控制和添加渗透压调节剂提高普鲁兰酶的可溶性表达水平：对重组酶在不同细胞组分中的定位分析发现，重组菌胞外上清和胞内上清中的普鲁兰酶活力分别只有3.2U mL-1和9.9U mL-1，而细胞破碎沉淀中酶活力是二者之和的2.2倍。结合SDS-PAGE、透射电镜和软件分析，推测这些非可溶成分是活性蛋白聚集体。为了减少重组酶在沉淀中的比例，提高它的可溶性表达水平，对发酵工艺进行了优化。首先在摇瓶中考察了诱导温度、诱导强度和渗透压调节剂对其可溶性表达的影响，结果显示：在较低的诱导温度（25°C）和低IPTG浓度（0.05mmol L-1）条件下，可溶性酶总活力是对照的2.7倍；而添加甜菜碱后，可溶性酶总活力达到48.9U mL-1，是对照组的1.6倍。在3L罐水平上建立了适用于普鲁兰酶可溶性表达的高密度发酵工艺。在25°C和添加甜菜碱的条件下，发酵36h，重组菌周质空间酶活力为946.5U mL-1，胞外上清酶活力仅有17.4U mL-1。虽然可溶性总酶活力比优化前提高了30.5倍，但是酶的胞外分泌效率较低。（4） N端结构域切除提高普鲁兰酶的胞外分泌效率及热稳定性：针对普鲁兰酶胞外分泌效率低的问题，对天然酶的N端结构域进行了切除，构建了4个N端截短的突变体，其中Puld1′，Puld1和Puld2分泌效率分别是天然酶的3.1倍、3.4倍和3.8倍；此外，还以双突变体（D437H/D503Y）为模板构建了2个叠加突变体。叠加突变体（D437H/D503Y/d1和D437H/D503Y/d2）的胞外分泌效率分别是对照的5.3倍和5.6倍。酶学性质分析显示，截短突变体的热稳定性都得到了提高，其中D437H/D503Y/d1和D437H/D503Y/d2半衰期分别是天然酶的9.0倍和7.1倍；它们的催化效率分别是天然酶的1.8倍和1.0倍。糖化复配应用结果表明，Puld1、Puld2的最大DX值与天然酶的最大DX（92.9%）值相当；叠加突变体D437H/D503Y/d1和D437H/D503Y/d2的最大DX值分别为95.0%和94.1%，分别比天然酶提高了2.1%和1.2%。（5）异淀粉酶的重组表达及在α-环糊精制备中的应用：环糊精制备用底物（大分支糊精）的结构中有大量CGTase难以利用的α-1,6-葡萄糖苷键，单独使用CGTase进行转化时，环糊精转化率较低。为了提高环糊精的转化率，需要开发能够对大分支底物高效脱支的淀粉脱支酶（异淀粉酶）。本研究在Thermobifida fusca基因组数据分析的基础上，发现了潜在的异淀粉酶编码基因Tfu1891。对其进行了克隆表达和酶学性质分析，结果显示该酶最适pH为5.5，最适温度为50°C，在50°C半衰期为30h。在3L罐中进行了重组菌的分批补料高密度发酵，菌体干重最高为68.5g L-1，酶活力最高为6876.9U mL-1。考察了重组酶与α-CGTase复配制备环糊精的应用效果，并对转化条件进行了优化。在最优条件下，环糊精总转化率为84.6%，比对照（单酶法）提高了24.3%，其中α-环糊精的比例为94.3%。