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蝮蛇Agkistrodon halys(Palls)或Agkistrodon biomboffi Boie为蝰科动物蝮蛇除去内脏的全体。蝮蛇药用首载于《别录》。《本草经集注》记载:“蝮蛇黄黑色,黄颌尖口,毒性强烈。”《本草纲目》记载:“蝮蛇具有祛风,攻毒之效”,常用于治疗风湿痹痛、麻风、瘰疬、疮疖、疥癣、痔疾,肿瘤等病症。自古以来,民间把蝮蛇作为滋补强壮、解除疲劳、增强体力;近代则主要用作强壮、病后和虚弱体质的滋补药物。在我国,蝮蛇主产于东北,资源丰富。本文主要以蝮蛇蛋白为原料,利用可控酶解技术,超滤和凝胶柱层析等分离手段,研究制备生物活性肽的方法,并进行体外清除羟基自由基(·OH)和小鼠壮阳抗疲劳药效学研究。在可控酶解工艺优化研究中,以木瓜蛋白酶与中性蛋白酶组成的复合蛋白酶为水解反应的催化剂,主要研究了水解体系pH值、水解时间、复合蛋白酶组成比例和用量、水解温度对酶解效果的影响,在底物浓度为3%时水解条件为:水解温度T=50℃,酶与底物浓度比[E]/[S]为6%,pH值为7.5,反应时间5h,复合酶(木瓜蛋白酶:中性蛋白酶)比例为1:7时,蝮蛇蛋白的水解度为21.6%,出膏率为51.58%,IC50=3.92mg/ml。然而,体外清除羟基自由基实验表明,水解产物的清除羟基自由基能力并不随水解度的增大而增强。以清除羟基自由基能力强弱为衡量指标,应用方差分析和效应曲线,筛选出最佳工艺条件为:在固定底物浓度为3%的条件下,水解温度T=45℃、体系pH=7.0、水解时间t=5h,酶与底物浓度比([E]/[S])=6%,复合蛋白酶组成比例(木:中)=1:5。此时水解度DH=19.28%,清除自由基能力衡量值IC50=3.70mg/ml。动物实验表明,利用最佳水解工艺生产的短肽能显著延长小鼠的游泳时间,活性肽的剂量与小白鼠的游泳时间呈正相关系;在雄性大鼠脏器指数影响考察试验中,肾脏、前列腺、睾丸、附睾检测指标均有显著性意义。实验结果证明:蝮蛇酶解活性肽有较好的壮阳抗疲劳生物活性。超滤分离方法表明,酶解液的水解度增大,平均肽链的减小,将提高组分的平均透过速率,降低截留率;证实了分离膜对水解液中不同分子量组分具有分离作用。本实验主要应用截留分子量大于3000Da纤维素膜,富集分子量小于3000Da的水解短肽。凝胶排阻法研究表明,分子量较大成分在较早的时间内被流动相洗脱,小分子量范围的成分后被洗脱,从而利用凝胶排阻色谱对不同分子量范围的短肽进行了富集纯化。本实验利用SephadexG-25、SephadexLH-20、SephadexG-15反复柱层析得到活性肽段部位FrⅠ。ODS-C8与ODS-C18为反相球形硅胶,利用中压制备色谱仪与高效液相色谱仪对活性肽段部位FrⅠ进行系统分离纯化,得到单体肽化合物AP.Ⅰ,利用ESI-MS对其进行结构鉴定,结果表明化合物AP.Ⅰ分子量M=245,结构式为H-LEU-ASN-OH的二肽化合物。利用ESI-MSn,对活性肽段部位FrationⅠ混合组分进行成分分析,从活性部位FrationⅠ中鉴定出H-LEU-ASN-OH、H-LYS-GLU-OH、H-ASN-GLU-OH、H-ARG-ASP-OH、H-ASN-VAL-OH、H-PHE-ASN-OH、H-ARG-GLU-OH七个二肽和H–ASN-VAL-ALA-OH一个三肽。