论文部分内容阅读
蜱是一种吸血性外寄生虫,作为媒介能够传播多种病原体,蜱的生活史包括卵、幼虫、若虫、成虫四个阶段。与很多传播媒介一样,蜱主要是通过叮咬宿主传递病原体,由于蜱需要吸血寄生且繁殖能力很强,目前对于蜱的防控并没有特效药物,利用新型防治策略控制蜱的成长和繁殖可以作为预防策略的关键措施,其中蜱的分子生物学基础研究必不可少。蜱的繁殖是蜱防控中的关键环节,卵黄蛋白(Vitellin,Vn)是蜱卵的主要成分,研究认为卵黄蛋白原(Vitellogenin,Vg)通过网格蛋白介导的内吞作用进入卵细胞,进而酶切形成卵黄蛋白,但具体机制不清。Vg是一种储存蛋白,在蜱中受拟保幼激素和蜕皮激素调节。Vg由卵黄蛋白原受体(Vitellogenin receptor,VgR)介导卵母细胞摄取以后,作为Vn储存在细胞质中,为卵母细胞发育提供物质及能量,对卵母细胞的发育十分重要。网格蛋白(Clathrin)是一个分子量大小为180kDa的蛋白质,网格蛋白是由其特有的“三联体骨架”组成的笼形蛋白,参与多种细胞生物学过程,包括物种的生长、繁殖和发育。Clathrin介导的内吞作用在营养吸收、病原入侵等多方面具有至关重要的作用。因此,本研究首次鉴定了蜱的网格蛋白的重链(Clathrin heavy chain,Chc)分子,并观察其在Vn生成过程中的功能。1.镰形扇头蜱(Rhipicephalus haemaphysaloides)Chc基因的克隆及序列分析采用PCR技术扩增了Rh-Chc的完整ORF序列,序列长度为5103 bp,共编码1670个氨基酸残基,ORF内有7个大小相同的CLH结构域。其理论等电点为5.52,脂肪系数为94.61,不稳定指数为38.83,属稳定蛋白,亲水性平均值为-0.221,属亲水性蛋白。系统发育分析表明,Rh-Chc编码的氨基酸序列与肩突硬蜱(Ixodes scapularis)的进化关系最近,其次为隆头蛛(Stegodyphus mimosarum)。2.Rh-Chc基因的原核表达及多克隆抗体的制备根据抗原表位预测选取978-1269位氨基酸序列,克隆了Rh-Chc基因的部分结构域,构建了Rh-Chc/pET30a重组表达质粒,测序结果显示,插入pET30a载体中的序列长度约827bp,利用Escherichia coli BL21(DE3)原核表达系统获得重组蛋白Rh-Chc进行了外源表达。SDS-PAGE电泳结果表明,Rh-Chc/pET30a重组质粒的阳性菌在IPTG的诱导下以包涵体形式表达Rh-Chc重组蛋白,蛋白大小约为28kDa。优化后的表达条件为1.0mM IPTG诱导,25℃培养16 h,此条件下可获得大量目的蛋白。以尿素作为变性剂,经过透析和纯化后获得高纯度目的蛋白,并用此蛋白制备了兔抗Rh-Chc多克隆抗体。另外,通过抗原表位预测筛选肽段(DRAYEFAERCNEPGVWSQL)并与KLH偶联,制备了鼠抗Rh-Chc多克隆抗体,蛋白质印迹(Western Blot)显示制备的Rh-Chc多克隆抗体能够与Rh-Chc蛋白特异性结合,显微解剖获得吸血第五天的卵巢,进行免疫荧光鉴定,结果表明制备的兔抗Rh-Chc多克隆抗体的特异性较好。3.Rh-Chc的差异表达和组织分布采用实时荧光定量PCR(quantitative Real-Time PCR,qRT-PCR)技术对Rh-Chc基因在镰形扇头蜱的各吸血阶段:卵、未吸血幼蜱、吸血幼蜱、饱血幼蜱、未吸血若蜱、吸血若蜱、未吸血成蜱(雌)、吸血成蜱(雌),以及成蜱(雌)不同吸血时期的(未吸血成蜱、吸血成蜱及饱血成蜱)卵巢、脂肪体、唾液腺、中肠中转录情况进行了研究,结果显示Rh-Chc在8个发育阶段及3个吸血时期成虫的4种组织中均有表达。在对蜱8个发育阶段的检测中,发现其在吸血幼蜱及未吸血成蜱阶段表达最高,而在未吸血若蜱中表达量最低。对3个吸血时期成虫的4种组织的检测中发现:未吸血阶段成蜱的脂肪体中表达量最高,其次为中肠,唾液腺中表达量相对较低;在吸血阶段和饱血阶段的成蜱的卵巢中表达量最高,其次为中肠,唾液腺和脂肪体中表达量最低。显微解剖获得成蜱(雌)吸血第三天的卵巢、唾液腺、中肠,进行免疫荧光检测发现Rh-Chc蛋白在唾液腺和卵巢中高表达。4.Rh-Chc的RNAi研究采用dsRNA介导的RNA干扰技术对Rh-Chc基因进行沉默,并利用qRT-PCR技术对Rh-Chc基因敲低水平进行了分析。结果显示显微注射ds RNA,24 h后大部分蜱均上体,但显微注射0.4μg ds Chc/只、0.8μg ds Chc/只、1.2μg ds Chc/只的试验组,随着浓度的升高,上体率逐渐减少。吸血第三天时,试验组随ds RNA浓度升高,蜱落体数越多。相比较于对照组(注射1.2μg ds Luciferas/只),三个试验组的ds Chc均影响蜱的生长且不能饱血,蜱的个体大小均小于对照组,不产卵,而对照组的蜱饱血率达到90%,产卵率为100%。通过qRT-PCR技术对干扰后吸血第三天的蜱进行Rh-Chc和Rh-Vg检测,发现干扰后Rh-Chc的转录水平降低,且Rh-Vg1、Rh-Vg2、Rh-Vg4的转录水平均显著下降,Rh-Vg3仅在显微注射0.4μg ds Chc/只与对照组相比,转录水平差异不显著,但随着浓度升高(显微注射0.8μg ds Chc/只、1.2μg ds Chc/只)转录水平也显著降低。5.Rh-Chc在镰形扇头蜱卵黄蛋白合成过程中的功能初探通过显微注射和体外卵巢组织培养,采用dsRNA干扰Rh-Chc基因的转录,并进行免疫荧光检测。结果显示在吸血第五天的成蜱(雌)体内显微注射dsRNA,48 h、96 h及144 h收集的卵巢中,卵母细胞发育程度明显减缓,且Rh-Vg的表达水平也由于Rh-Chc的沉默而降低。将显微解剖获得的成蜱(雌)吸血第三天、吸血第五天、饱血第一天、饱血第三天、饱血第五天、饱血第七天的卵巢放至L-15培养基中培养并加入dsRNA后,除饱血第一天的卵巢中的Rh-Vg的表达水平升高以外,其他阶段Rh-Vg的表达水平均减少,dsRNA干扰结果均与显微注射、L-15培养基中加入内吞途径抑制剂Pitstop-2结果一致,说明在外源性及内源性卵黄蛋白合成的过程中,Rh-Chc沉默后,卵巢中的卵黄蛋白生成减少,并且发现Rh-Chc与Rh-VgR共定位于吸血第三天的卵母细胞的细胞膜上,猜测Rh-Vg可能通过Rh-VgR的介导,由Rh-Chc影响Rh-Vg的形成。Rh-Chc对蜱的生长发育及繁殖过程都具有重要作用,且能够参与Rh-Vn的形成及卵巢的发育,是蜱的繁殖及蜱传病研究中的关键分子,可作为潜在的药物靶点,为进一步研究蜱及蜱传病的防治提供参考。