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5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,简称ALA)是生物合成四吡咯的前体,而四吡咯是构成生物体必不可少的物质。ALA对人畜无毒性,在环境中易降解、无残留,是一种无公害的绿色农用化学品。在医学领域,ALA可作为抗癌药物的中间体,作为检验铅中毒的主要试剂。1999年12月,美国FDA正式批准ALA为治疗皮肤癌前期的光动力药物,ALA在治疗其它表皮癌症中的应用也得到了越来越多科学家的兴趣。作为第二代光动力药,ALA的显著优点是副作用小、渗透性好、疗效确切、对疾病的适用范围广及价格低等。本研究以NCBI数据库(M57676)的枯草芽抱杆菌基因组中的hemA和hemL基因序列为模板设计PCR引物,经PCR扩增得到hemA和hemL基因片段,并克隆到pGEM-T-Vector载体上,得到重组质粒pGEM-T-hemA和pGEM-T-hemL。酶切回收hemA和hemL基因片段并克隆到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体(pGJ113)的Pglv启动子下游EcoR?和Not?位点间,构建hemA和hemL基因的表达载体pGJ216和pGJ218。将两个表达载体分别电转化至B. subtilis 1A747感受态细胞中,用麦芽糖进行诱导表达,SDS-PAGE凝胶扫描分析显示,目标蛋白HemA和HemL分别占胞内总可溶性蛋白的11 %和13 %,实现了hemA和hemL基因的高效表达。重组菌B. subtilis(pGJ216)和B. subtilis(pGJ218)的发酵液上清中5-氨基乙酰丙酸含量分别达到26.31 mg/L和24.47 mg/L,菌液呈红色,紫外分光光度检测验证显色的为卟啉类物质。试验表明,表达的重组蛋白具有生理活性并促进了枯草芽孢杆菌中5-氨基乙酰丙酸的合成,并且分解代谢途径也加快。对构建的表达载体pGJ216和pGJ218进行优化,将突变的Pglv启动子-PglvM分别克隆到pGJ216和pGJ218中hemA和hemL基因的上游,替换Pglv启动子,得到表达载体pGJ216M和pGJ218M,将其电转化至B. subtilis 1A747感受态细胞中,用麦芽糖进行诱导表达。SDS-PAGE电泳分析显示,pGJ216M和pGJ218M的表达蛋白在50 KD附近有一条明显的条带,而对照菌没有明显的蛋白条带,结果表明得到较大量的谷氨酰t-RNA还原酶蛋白和谷氨酰t-RNA合成酶蛋白,并且在枯草芽孢杆菌中实现了高效表达。优化后的表达载体pGJ216M和pGJ218M比表达载体pGJ216和pGJ218的诱导表达效果更好,生成的5-氨基乙酰丙酸含量更多。诱导表达促进了5-氨基乙酰丙酸的生物合成代谢途径,并加快了5-氨基乙酰丙酸的合成速度。