论文部分内容阅读
背景：
多肽受体介导的放射性核素治疗(peptide receptor radionuclide therapy，PRRT)已成为一种重要的肿瘤精准治疗手段，其利用多肽与特异性受体的结合，将治疗用放射性核素定向运送到病变组织和细胞，通过放射性核素释放的α、β射线、俄歇电子、内转换电子产生生物电离作用，对肿瘤产生杀伤作用，从而达到治疗目的。PRRT综合了放射治疗和靶向治疗的优势，对肿瘤细胞的选择性杀伤和个性化治疗的特点，使得肿瘤放射性核素治疗越来越被重视，在肿瘤综合治疗中有着举足轻重的地位。然而，由于多肽在体内主要经由肾脏排泄，会导致与多肽连接的放射性核素长时间过高地浓聚于肾。因此，PRRT在治疗肿瘤的同时会对肾脏造成可观的放射性损伤，故其治疗剂量受到了严重制约，不仅降低了应有的肿瘤治疗效果，也使治疗的安全性受到了影响。
放射性多肽药物之所以会在肾脏中产生较高的辐射剂量，源于如下两方面原因：①小分子多肽药物主要经由肾脏排泄。报道显示，当分子尺寸小于1.8nm或分子量小于12kDa时，分子可以自由地通过肾小球膜的孔隙；而当分子尺寸大于4.2nm或分子量大于70kDa时，分子则不能或只能很少量地通过肾小球膜的孔隙。而几乎所有的多肽都小于12kDa，因而PRRT多肽药物在体内主要经由肾脏清除，分布上就表现为放射性大量浓聚于肾。②小分子多肽药物的代谢片段会被肾小管重吸收。经肾小球滤过后，绝大部分进入原尿中的多肽药物片段，会在肾小管近曲小管处经主动转运而重吸收，分布上表现为放射性药物长时间滞留于肾皮质。
上述两方面机制使放射性多肽药物富集并滞留于肾脏内，导致肾脏受到高强度和持续性的照射，因此，如何降低放射性在肾脏中的富集和滞留水平成为解决放射性肾损伤的关键。
针对上述的两方面因素，学者们提出了两类解决办法：
①放射性多肽的结构修饰。既往研究采用在多肽结构中引入负电荷连接剂以改变分子表面的电荷、插入PEG3基团改变药代动力学性能等结构修饰方法降低肾脏摄取。但是，上述方法仅应用于99mTc和188Re核素的共价标记或大分子蛋白质标记，在177Lu-DOTA鳌合标记为主的PRRT治疗中的可行性尚不明确；且结构修饰存在改变多肽电荷、空间位阻、疏水性等性能变化，可能对探针的靶点结合性能产生潜在的影响。
②抑制放射性多肽经肾的重吸收作用。放射性多肽的重吸收是一个主动运输过程，需要转运蛋白的协助，而带正电荷的赖氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)可以在一定程度上竞争结合转运蛋白，从而抑制放射性代谢产物的重吸收。报道显示，在生长抑素受体类似物的核素治疗中，使用Lys干预后，肾摄取最高可降低50%。但是，持续大剂量的注入氨基酸会引发许多严重的毒副反应，如呕吐，恶心和高钾血症等。针对177Lu-PSMA-617，有报道采用甘露糖的利尿作用降低其肾脏重吸收，但平均抑制率仅为22.4-24.3%，且效果变异极大(抑制率由-2.4%至36.19%)，同时亦存在脱水剂的临床应用适用征限制。
综上，多肽结构修饰和抑制重吸收的两类策略，虽然都具有降低肾脏摄取的效果，但仍存在肿瘤靶向性能降低、作用效果有限以及毒副反应明显等诸多问题，仍需探索效果更优、安全性更好的解决方案。
放射性酶切清除策略是基于在肾中高表达的酶的酶切作用，将放射性核素与代谢片段分离，从而使放射性核素免于重吸收，快速进入膀胱，进而被清除出体内。日本YasushiArano课题组在188Re标记的抗体片段中，插入可被酶降解的序列Gly-Lys，成功将注射后1h的肾脏摄取从33.86%ID/g降至6.43%ID/g。在后续的研究中，他们在131I标记的抗体片段中，比较了不同酶切序列Gly-Lys和Gly-Tyr的性能差异，发现二者都能显著降低肾摄取，且Gly-Tyr更优于Gly-Lys。然而，上述酶切序列存在酶切效率偏低的突出问题，抑制试验表明，该底物的酶切效率仅约40%，仍需进一步优化。此后，基于中性内肽酶(neutral endopeptidase，NEP)在肾脏中高表达的特点，该课题组设计出特异性高的NEP酶切序列蛋氨酸-缬氨酸-赖氨酸(Met-Val-Lys, MVK)，并在67Ga标记的抗体中插入该序列，抑制剂研究表明，该序列可被NEP特异性切割，酶切抑制率高达75%，同样观察到注射后3h的肿瘤/肾脏摄取比值显著提升4-7倍，而肿瘤的摄取没有显著性差异。此外，研究显示，NEP对底物具有高度的选择性，能特异性切割含有苯环或较大空间结构侧链的疏水氨基酸。基于此，我们推测将酶切序列MVK中的缬氨酸(V)换成苯丙氨酸(F)后，得到的新序列蛋氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸(Met-Phe-Lys, MFK)，与酶的亲和力更强，切割效率更高，从而使放射性核素更快清除出体内。
GLP-1R靶向的核素诊疗在胰岛素瘤中有重要的应用，但是与其他多肽化合物类似，其配体Exendin4也面临高肾摄取的问题，一方面由于胰尾与左肾非常近，肾的高信号可能会影响胰尾病灶的诊断；另一方面放射性在肾的高摄取，限制了核素治疗中的给药剂量和给药疗程数。
综上所述，本研究拟采用酶切清除策略，以改善放射性核素标记的Exendin4在肾中的高浓聚和长时间滞留问题。本研究拟将两个不同的酶切序列MVK和MFK，插入到Cys40-Leu14-Exendin4与双功能螯合剂NOTA之间，通过68Ga的标记，制备得到放射性探针，利用体内、外代谢实验及PET显像研究，探究该放射性酶切清除策略的可行性与有效性，并进一步比较、评价MVK与MFK的酶切效率。
目的：
1.运用酶切清除策略降低放射性Exendin4在肾中的浓聚。
2.研发新型高效放射性酶切清除序列。
3.打造适用于其他多肽的一体化酶切平台，为解决多肽核素治疗的放射性肾损伤问题提供新思路。
方法：
1、制备修饰有酶切序列MVK及MFK的新探针NOTA-MVK-Cys40-Leu14-Exendin4和NOTA-MFK-Cys40-Leu14-Exendin4以及对照探针NOTA-Cys40-Leu14-Exendin4，用液相色谱-质谱(LC-MS)对产物进行结构鉴定，用高效液相色谱法(HPLC)对产物纯度进行分析。
2、分离纯化得到的标记前体NOTA-Cys40-Leu14-Exendin4、NOTA-MVK-Cys40-Leu14-Exendin4和NOTA-MFK-Cys40-Leu14-Exendin4用超纯水溶解成1μg/μL的浓度，每管分装10μL。标记时，每管加入200μL1MHEPES缓冲液，200μL新鲜淋洗的68GaCl3,(5~6mCi)，于37℃下孵育15min。标记结束后，取一预先纯化过的C18分离小柱(先用5mL乙醇缓慢淋洗，再用5mL水淋洗)，通过注射器将标记混合物上样至C18分离小柱，用5mL水将游离的68Ga3+洗去，之后用200μL0.1%乙酸的乙醇溶液淋洗，收集淋洗液，用活度计测放射性活度。测定标记产物的PBS及鼠血清稳定性，通过竞争性细胞结合实验评价各探针对受体的亲和力。
3、将底物Boc-MFK/MVK-Dde与肾刷状缘膜酶提取物置于37度下共孵育，分别于10,30,60,120min后取出适量孵育液，加入等体积的乙腈以终止反应，离心取上清液进行HPLC检测。收集HPLC检测到的切割片段，进行质谱检测。根据质谱结果，分析底物的酶切位点。通过加入NEP的抑制剂评价Boc-MFK/MVK-Dde是否为NEP的特异性底物。在相同条件下，对Boc-MFK/MVK-Dde进行多时间点孵育，通过比较底物量的变化，来比较Boc-MFK/MVK-Dde二者的体外酶切效率。
4、通过尾静脉向正常鼠注射100μL18MBq的68Ga-NOTA-MVK-Cys40-Leu14-Exendin4或68Ga-NOTA-MFK-Cys40-Leu14-Exendin4，于20min时将其处死，取尿液和肾脏，向尿液样本中加入等体积的乙腈以沉淀蛋白，132000rpm下离心10min，取上清进行Radio-HPLC分析。肾脏样品先经匀浆器匀浆，再加入乙腈沉淀蛋白，经离心后取上清进行Radio-HPLC分析。
5、在裸鼠的右侧腋下建立大鼠胰腺β细胞INS-1移植瘤模型。比较68Ga-NOTA-Cys40-Leu14-Exendin4、68Ga-NOTA-MVK-Cys40-Leu14-Exendin4和68Ga-NOTA-MFK-Cys40-Leu14-Exendin4在荷瘤裸鼠的microPET显像；分别将三个探针与过量的未标记的Cys40-Leu14-Exendin4共注射，行竞争microPET/CT显像；勾画肿瘤和肾脏的摄取，比较三者在肿瘤和肾脏的分布特点。上述行PET显像的裸鼠，分别于显像1及2h后处死，取血(开胸用1mL注射器刺入左心室抽吸)、瘤体及主要脏器(心、肝、肺、肾、脾、胃、骨、肉、肠)，分别测定重量及放射性计数，经时间衰减校正后计算%ID/g。
结果：
1、新探针NOTA-MVK-Cys40-Leu14-Exendin4和NOTA-MFK-Cys40-Leu14-Exendin4以及对照探针NOTA-Cys40-Leu14-Exendin4的结构经质谱鉴定无误，纯度经HPLC分析为＞95%。三种探针经C18小柱纯化后，收率约为56%(未衰减校正)，放射化学纯度均大于95%，比活度约为95.6±22.4GBq/μmol。
2、竞争结合实验中，通过非线性拟合获得Exendin4、NOTA-Cys40-Leu14-Exendin4、NOTA-MVK-Cys40-Leu14-Exendin4和NOTA-MFK-Cys40-Leu14-Exendin4的IC50值分别为0.42±0.02、0.46±0.02、0.80±0.03和0.58±0.03nM。四者中，未经任何修饰的Exendin4具有最低的IC50值，其次是NOTA-Cys40-Leu14-Exendin4，再次是NOTA-MFK-Cys40-Leu14-Exendin4和NOTA-MVK-Cys40-Leu14-Exendin4，但是四者间没有显著性差异(p＞0.05)。
3、在PBS中室温放置3h后，三者的放化纯均大于70%，68Ga-NOTA-Cys40-Leu14-Exendin4和68Ga-NOTA-MVK-Cys40-Leu14-Exendin4的放化纯甚至＞95%，表明三者具有良好的PBS稳定性。在鼠血清中37℃下孵育1h，三种标记物都未见分解，放化纯均大于95%，表明68Ga-NOTA-Cys40-Leu14-Exendin4，68Ga-NOTA-MVK-Cys40-Leu14-Exendin4和68Ga-NOTA-MFK-Cys40-Leu14-Exendin4在血清中稳定性良好。
4、体外酶切孵育实验以及抑制实验说明：①Boc-MVK-Dde和Boc-MFK-Dde均是NEP的特异性酶切底物；②酶切位点是Met与其相邻的氨基酸之间的酰胺键，对Boc-MVK-Dde而言，酶切位点是Met与Val的酰胺键，同理对Boc-MFK-Dde而言，酶切位点是Met与Phe之间的酰胺键。③在相同的条件下，Boc-MFK-Dde的酶切效率显著快于Boc-MVK-Dde的酶切效率。
5、体内代谢结果显示，注射了68Ga-NOTA-MVK-Cys40-Leu14-Exendin4或68Ga-NOTA-MFK-Cys40-Leu14-Exendin4的小鼠，其肾脏和尿液代谢物中均检测到了68Ga-NOTA-Met-OH。对于68Ga-NOTA-MVK-Cys40-Leu14-Exendin4而言，68Ga-NOTA-Met-OH在尿液和肾脏代谢物中的占比分别为46%和64.8%，而对于68Ga-NOTA-MFK-Cys40-Leu14-Exendin4而言，68Ga-NOTA-Met-OH在尿液和肾脏代谢物中的占比则分别为56%和50%。
6、小动物PET显像结果显示，三种探针在INS-1肿瘤中均有明显摄取，摄取值约为18%ID/g，三者之间没有显著性差异(P＜0.05)。三者的肾摄取在注射探针5min后处于相同的水平，为28%ID/g，在此后的时间里，控制组68Ga-NOTA-Cys40-Leu14-Exendin4的肾摄取持续升高，而68Ga-NOTA-MVK-Cys40-Leu14-Exendin4和68Ga-NOTA-MFK-Cys40-Leu14-Exendin4则在前30min内缓慢上升，并于30-45min之间达到峰值，之后缓慢下降。因而68Ga-NOTA-Cys40-Leu14-Exendin4的瘤肾比值在注射后0.5、1和2h时极显著低于另外两组(P＜0.01)。68Ga-NOTA-MVK-Cys40-Leu14-Exendin4的瘤肾比在0.5h时显著低于(P＜0.05)、并在1和2h时极显著低于(P＜0.01)68Ga-NOTA-MFK-Cys40-Leu14-Exendin4的瘤肾比。三种探针在全身本底均较低，除肿瘤、肾和膀胱有摄取外，其余脏器未见明显放射性摄取。
7、68Ga-NOTA-Cys40-Leu14-Exendin4及68Ga-NOTA-MVK-Cys40-Leu14-Exendin4的生物分布结果显示，放射性摄取最高的脏器是肾，其次是肿瘤，生理性表达GLP-1R的脏器，如肺、胰腺等也有放射性浓聚，其他脏器如心、肝、脾、胃、肠、骨、肉等均为本底水平。与PET显像的结果一致，68Ga-NOTA-Cys40-Leu14-Exendin4及68Ga-NOTA-MVK-Cys40-Leu14-Exendin4在1h和2h的肿瘤摄取相当，但是68Ga-NOTA-Cys40-Leu14-Exendin4的肾摄取由1h的70.81±8.05%ID/g上升为2h的94.24±9.76%ID/g，均显著高于68Ga-NOTA-MVK-Cys40-Leu14-Exendin4在相同时间点的摄取。当用过量的Cys40-Leu14-Exendin4进行阻断实验时，肿瘤摄取可被完全阻断，肺、胰腺等GLP-1R表达的脏器中的摄取也被显著阻断。
结论：
针对放射性多肽诊疗技术中肾浓聚高的突出问题，本课题采用放射性酶切清除策略，通过在放射性核素和Exendin4探针间加入中性内肽酶(NEP)特异性酶切序列的方式，实现二者在肾脏的特异性切割分离，避免核素的重吸收，从而降低放射性在肾脏的浓聚。本课题筛选得到的高效酶切序列MFK，在2h时可将放射性Exendin4的肾浓聚降低约73%，极大地提升了核素诊疗的安全性。本研究筛选得到的高效酶切序列MFK，有望推广至其他放射性多肽化合物，从而为放射性多肽诊疗中的肾保护提供新途径。该课题以临床问题为切入点，降低肾浓聚的效果显著，具有较高的应用价值和重大的临床意义。
多肽受体介导的放射性核素治疗(peptide receptor radionuclide therapy，PRRT)已成为一种重要的肿瘤精准治疗手段，其利用多肽与特异性受体的结合，将治疗用放射性核素定向运送到病变组织和细胞，通过放射性核素释放的α、β射线、俄歇电子、内转换电子产生生物电离作用，对肿瘤产生杀伤作用，从而达到治疗目的。PRRT综合了放射治疗和靶向治疗的优势，对肿瘤细胞的选择性杀伤和个性化治疗的特点，使得肿瘤放射性核素治疗越来越被重视，在肿瘤综合治疗中有着举足轻重的地位。然而，由于多肽在体内主要经由肾脏排泄，会导致与多肽连接的放射性核素长时间过高地浓聚于肾。因此，PRRT在治疗肿瘤的同时会对肾脏造成可观的放射性损伤，故其治疗剂量受到了严重制约，不仅降低了应有的肿瘤治疗效果，也使治疗的安全性受到了影响。
放射性多肽药物之所以会在肾脏中产生较高的辐射剂量，源于如下两方面原因：①小分子多肽药物主要经由肾脏排泄。报道显示，当分子尺寸小于1.8nm或分子量小于12kDa时，分子可以自由地通过肾小球膜的孔隙；而当分子尺寸大于4.2nm或分子量大于70kDa时，分子则不能或只能很少量地通过肾小球膜的孔隙。而几乎所有的多肽都小于12kDa，因而PRRT多肽药物在体内主要经由肾脏清除，分布上就表现为放射性大量浓聚于肾。②小分子多肽药物的代谢片段会被肾小管重吸收。经肾小球滤过后，绝大部分进入原尿中的多肽药物片段，会在肾小管近曲小管处经主动转运而重吸收，分布上表现为放射性药物长时间滞留于肾皮质。
上述两方面机制使放射性多肽药物富集并滞留于肾脏内，导致肾脏受到高强度和持续性的照射，因此，如何降低放射性在肾脏中的富集和滞留水平成为解决放射性肾损伤的关键。
针对上述的两方面因素，学者们提出了两类解决办法：
①放射性多肽的结构修饰。既往研究采用在多肽结构中引入负电荷连接剂以改变分子表面的电荷、插入PEG3基团改变药代动力学性能等结构修饰方法降低肾脏摄取。但是，上述方法仅应用于99mTc和188Re核素的共价标记或大分子蛋白质标记，在177Lu-DOTA鳌合标记为主的PRRT治疗中的可行性尚不明确；且结构修饰存在改变多肽电荷、空间位阻、疏水性等性能变化，可能对探针的靶点结合性能产生潜在的影响。
②抑制放射性多肽经肾的重吸收作用。放射性多肽的重吸收是一个主动运输过程，需要转运蛋白的协助，而带正电荷的赖氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)可以在一定程度上竞争结合转运蛋白，从而抑制放射性代谢产物的重吸收。报道显示，在生长抑素受体类似物的核素治疗中，使用Lys干预后，肾摄取最高可降低50%。但是，持续大剂量的注入氨基酸会引发许多严重的毒副反应，如呕吐，恶心和高钾血症等。针对177Lu-PSMA-617，有报道采用甘露糖的利尿作用降低其肾脏重吸收，但平均抑制率仅为22.4-24.3%，且效果变异极大(抑制率由-2.4%至36.19%)，同时亦存在脱水剂的临床应用适用征限制。
综上，多肽结构修饰和抑制重吸收的两类策略，虽然都具有降低肾脏摄取的效果，但仍存在肿瘤靶向性能降低、作用效果有限以及毒副反应明显等诸多问题，仍需探索效果更优、安全性更好的解决方案。
放射性酶切清除策略是基于在肾中高表达的酶的酶切作用，将放射性核素与代谢片段分离，从而使放射性核素免于重吸收，快速进入膀胱，进而被清除出体内。日本YasushiArano课题组在188Re标记的抗体片段中，插入可被酶降解的序列Gly-Lys，成功将注射后1h的肾脏摄取从33.86%ID/g降至6.43%ID/g。在后续的研究中，他们在131I标记的抗体片段中，比较了不同酶切序列Gly-Lys和Gly-Tyr的性能差异，发现二者都能显著降低肾摄取，且Gly-Tyr更优于Gly-Lys。然而，上述酶切序列存在酶切效率偏低的突出问题，抑制试验表明，该底物的酶切效率仅约40%，仍需进一步优化。此后，基于中性内肽酶(neutral endopeptidase，NEP)在肾脏中高表达的特点，该课题组设计出特异性高的NEP酶切序列蛋氨酸-缬氨酸-赖氨酸(Met-Val-Lys, MVK)，并在67Ga标记的抗体中插入该序列，抑制剂研究表明，该序列可被NEP特异性切割，酶切抑制率高达75%，同样观察到注射后3h的肿瘤/肾脏摄取比值显著提升4-7倍，而肿瘤的摄取没有显著性差异。此外，研究显示，NEP对底物具有高度的选择性，能特异性切割含有苯环或较大空间结构侧链的疏水氨基酸。基于此，我们推测将酶切序列MVK中的缬氨酸(V)换成苯丙氨酸(F)后，得到的新序列蛋氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸(Met-Phe-Lys, MFK)，与酶的亲和力更强，切割效率更高，从而使放射性核素更快清除出体内。
GLP-1R靶向的核素诊疗在胰岛素瘤中有重要的应用，但是与其他多肽化合物类似，其配体Exendin4也面临高肾摄取的问题，一方面由于胰尾与左肾非常近，肾的高信号可能会影响胰尾病灶的诊断；另一方面放射性在肾的高摄取，限制了核素治疗中的给药剂量和给药疗程数。
综上所述，本研究拟采用酶切清除策略，以改善放射性核素标记的Exendin4在肾中的高浓聚和长时间滞留问题。本研究拟将两个不同的酶切序列MVK和MFK，插入到Cys40-Leu14-Exendin4与双功能螯合剂NOTA之间，通过68Ga的标记，制备得到放射性探针，利用体内、外代谢实验及PET显像研究，探究该放射性酶切清除策略的可行性与有效性，并进一步比较、评价MVK与MFK的酶切效率。
目的：
1.运用酶切清除策略降低放射性Exendin4在肾中的浓聚。
2.研发新型高效放射性酶切清除序列。
3.打造适用于其他多肽的一体化酶切平台，为解决多肽核素治疗的放射性肾损伤问题提供新思路。
方法：
1、制备修饰有酶切序列MVK及MFK的新探针NOTA-MVK-Cys40-Leu14-Exendin4和NOTA-MFK-Cys40-Leu14-Exendin4以及对照探针NOTA-Cys40-Leu14-Exendin4，用液相色谱-质谱(LC-MS)对产物进行结构鉴定，用高效液相色谱法(HPLC)对产物纯度进行分析。
2、分离纯化得到的标记前体NOTA-Cys40-Leu14-Exendin4、NOTA-MVK-Cys40-Leu14-Exendin4和NOTA-MFK-Cys40-Leu14-Exendin4用超纯水溶解成1μg/μL的浓度，每管分装10μL。标记时，每管加入200μL1MHEPES缓冲液，200μL新鲜淋洗的68GaCl3,(5~6mCi)，于37℃下孵育15min。标记结束后，取一预先纯化过的C18分离小柱(先用5mL乙醇缓慢淋洗，再用5mL水淋洗)，通过注射器将标记混合物上样至C18分离小柱，用5mL水将游离的68Ga3+洗去，之后用200μL0.1%乙酸的乙醇溶液淋洗，收集淋洗液，用活度计测放射性活度。测定标记产物的PBS及鼠血清稳定性，通过竞争性细胞结合实验评价各探针对受体的亲和力。
3、将底物Boc-MFK/MVK-Dde与肾刷状缘膜酶提取物置于37度下共孵育，分别于10,30,60,120min后取出适量孵育液，加入等体积的乙腈以终止反应，离心取上清液进行HPLC检测。收集HPLC检测到的切割片段，进行质谱检测。根据质谱结果，分析底物的酶切位点。通过加入NEP的抑制剂评价Boc-MFK/MVK-Dde是否为NEP的特异性底物。在相同条件下，对Boc-MFK/MVK-Dde进行多时间点孵育，通过比较底物量的变化，来比较Boc-MFK/MVK-Dde二者的体外酶切效率。
4、通过尾静脉向正常鼠注射100μL18MBq的68Ga-NOTA-MVK-Cys40-Leu14-Exendin4或68Ga-NOTA-MFK-Cys40-Leu14-Exendin4，于20min时将其处死，取尿液和肾脏，向尿液样本中加入等体积的乙腈以沉淀蛋白，132000rpm下离心10min，取上清进行Radio-HPLC分析。肾脏样品先经匀浆器匀浆，再加入乙腈沉淀蛋白，经离心后取上清进行Radio-HPLC分析。
5、在裸鼠的右侧腋下建立大鼠胰腺β细胞INS-1移植瘤模型。比较68Ga-NOTA-Cys40-Leu14-Exendin4、68Ga-NOTA-MVK-Cys40-Leu14-Exendin4和68Ga-NOTA-MFK-Cys40-Leu14-Exendin4在荷瘤裸鼠的microPET显像；分别将三个探针与过量的未标记的Cys40-Leu14-Exendin4共注射，行竞争microPET/CT显像；勾画肿瘤和肾脏的摄取，比较三者在肿瘤和肾脏的分布特点。上述行PET显像的裸鼠，分别于显像1及2h后处死，取血(开胸用1mL注射器刺入左心室抽吸)、瘤体及主要脏器(心、肝、肺、肾、脾、胃、骨、肉、肠)，分别测定重量及放射性计数，经时间衰减校正后计算%ID/g。
结果：
1、新探针NOTA-MVK-Cys40-Leu14-Exendin4和NOTA-MFK-Cys40-Leu14-Exendin4以及对照探针NOTA-Cys40-Leu14-Exendin4的结构经质谱鉴定无误，纯度经HPLC分析为＞95%。三种探针经C18小柱纯化后，收率约为56%(未衰减校正)，放射化学纯度均大于95%，比活度约为95.6±22.4GBq/μmol。
2、竞争结合实验中，通过非线性拟合获得Exendin4、NOTA-Cys40-Leu14-Exendin4、NOTA-MVK-Cys40-Leu14-Exendin4和NOTA-MFK-Cys40-Leu14-Exendin4的IC50值分别为0.42±0.02、0.46±0.02、0.80±0.03和0.58±0.03nM。四者中，未经任何修饰的Exendin4具有最低的IC50值，其次是NOTA-Cys40-Leu14-Exendin4，再次是NOTA-MFK-Cys40-Leu14-Exendin4和NOTA-MVK-Cys40-Leu14-Exendin4，但是四者间没有显著性差异(p＞0.05)。
3、在PBS中室温放置3h后，三者的放化纯均大于70%，68Ga-NOTA-Cys40-Leu14-Exendin4和68Ga-NOTA-MVK-Cys40-Leu14-Exendin4的放化纯甚至＞95%，表明三者具有良好的PBS稳定性。在鼠血清中37℃下孵育1h，三种标记物都未见分解，放化纯均大于95%，表明68Ga-NOTA-Cys40-Leu14-Exendin4，68Ga-NOTA-MVK-Cys40-Leu14-Exendin4和68Ga-NOTA-MFK-Cys40-Leu14-Exendin4在血清中稳定性良好。
4、体外酶切孵育实验以及抑制实验说明：①Boc-MVK-Dde和Boc-MFK-Dde均是NEP的特异性酶切底物；②酶切位点是Met与其相邻的氨基酸之间的酰胺键，对Boc-MVK-Dde而言，酶切位点是Met与Val的酰胺键，同理对Boc-MFK-Dde而言，酶切位点是Met与Phe之间的酰胺键。③在相同的条件下，Boc-MFK-Dde的酶切效率显著快于Boc-MVK-Dde的酶切效率。
5、体内代谢结果显示，注射了68Ga-NOTA-MVK-Cys40-Leu14-Exendin4或68Ga-NOTA-MFK-Cys40-Leu14-Exendin4的小鼠，其肾脏和尿液代谢物中均检测到了68Ga-NOTA-Met-OH。对于68Ga-NOTA-MVK-Cys40-Leu14-Exendin4而言，68Ga-NOTA-Met-OH在尿液和肾脏代谢物中的占比分别为46%和64.8%，而对于68Ga-NOTA-MFK-Cys40-Leu14-Exendin4而言，68Ga-NOTA-Met-OH在尿液和肾脏代谢物中的占比则分别为56%和50%。
6、小动物PET显像结果显示，三种探针在INS-1肿瘤中均有明显摄取，摄取值约为18%ID/g，三者之间没有显著性差异(P＜0.05)。三者的肾摄取在注射探针5min后处于相同的水平，为28%ID/g，在此后的时间里，控制组68Ga-NOTA-Cys40-Leu14-Exendin4的肾摄取持续升高，而68Ga-NOTA-MVK-Cys40-Leu14-Exendin4和68Ga-NOTA-MFK-Cys40-Leu14-Exendin4则在前30min内缓慢上升，并于30-45min之间达到峰值，之后缓慢下降。因而68Ga-NOTA-Cys40-Leu14-Exendin4的瘤肾比值在注射后0.5、1和2h时极显著低于另外两组(P＜0.01)。68Ga-NOTA-MVK-Cys40-Leu14-Exendin4的瘤肾比在0.5h时显著低于(P＜0.05)、并在1和2h时极显著低于(P＜0.01)68Ga-NOTA-MFK-Cys40-Leu14-Exendin4的瘤肾比。三种探针在全身本底均较低，除肿瘤、肾和膀胱有摄取外，其余脏器未见明显放射性摄取。
7、68Ga-NOTA-Cys40-Leu14-Exendin4及68Ga-NOTA-MVK-Cys40-Leu14-Exendin4的生物分布结果显示，放射性摄取最高的脏器是肾，其次是肿瘤，生理性表达GLP-1R的脏器，如肺、胰腺等也有放射性浓聚，其他脏器如心、肝、脾、胃、肠、骨、肉等均为本底水平。与PET显像的结果一致，68Ga-NOTA-Cys40-Leu14-Exendin4及68Ga-NOTA-MVK-Cys40-Leu14-Exendin4在1h和2h的肿瘤摄取相当，但是68Ga-NOTA-Cys40-Leu14-Exendin4的肾摄取由1h的70.81±8.05%ID/g上升为2h的94.24±9.76%ID/g，均显著高于68Ga-NOTA-MVK-Cys40-Leu14-Exendin4在相同时间点的摄取。当用过量的Cys40-Leu14-Exendin4进行阻断实验时，肿瘤摄取可被完全阻断，肺、胰腺等GLP-1R表达的脏器中的摄取也被显著阻断。
结论：
针对放射性多肽诊疗技术中肾浓聚高的突出问题，本课题采用放射性酶切清除策略，通过在放射性核素和Exendin4探针间加入中性内肽酶(NEP)特异性酶切序列的方式，实现二者在肾脏的特异性切割分离，避免核素的重吸收，从而降低放射性在肾脏的浓聚。本课题筛选得到的高效酶切序列MFK，在2h时可将放射性Exendin4的肾浓聚降低约73%，极大地提升了核素诊疗的安全性。本研究筛选得到的高效酶切序列MFK，有望推广至其他放射性多肽化合物，从而为放射性多肽诊疗中的肾保护提供新途径。该课题以临床问题为切入点，降低肾浓聚的效果显著，具有较高的应用价值和重大的临床意义。