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背景与目的自从19世纪免疫治疗开始应用于癌症后,越来越多的免疫疗法出现,并展现了强大的根除肿瘤细胞的能力,比如免疫检查点抑制剂(ICI)、肿瘤疫苗、CAR-T细胞等都取得了空前的疗效,其中CD19 CAR-T细胞在治疗B细胞来源的血液系统恶性肿瘤上效果尤为显著。但CAR-T的离体扩增目前主要依靠IL-2,获得的多是终末阶段的效应细胞,增殖能力和免疫记忆能力弱,不能发挥长期的抗瘤效应,病人需多次输注CAR-T,可能会加重患者负担,甚至带来强烈的毒副作用。记忆细胞具有自我更新和分化的能力,能够更持久杀伤肿瘤细胞,因此提高记忆细胞比例是优化CAR-T免疫治疗的关键。IL-7、IL-2、IL-15三者强烈协同可以保留记忆细胞表型并增强CAR-T细胞毒性作用;Akt抑制剂(Akti)不会影响CD19 CAR-T细胞增殖,还会使已分化的CTL转录重排,转化为记忆细胞.本研究旨在探讨Akti联合混合细胞因子(IL-2/7/15/21)培养CD 19 CAR-T生物学功能的影响,找出一种有效增强CAR-T功能及延长其在体内存在的培养体系,从而为后续CAR-T细胞研究和临床应用提供有益的线索。方法1.采用分子生物学方法构建CD19 CAR慢病毒,提取人外周血单个核细胞并纯化为CD3+T细胞,将慢病毒转染入CD3+T细胞内,分别在IL-2、Akti联合IL-2、Akti联合混合细胞因子(IL-2/7/15/21)三种体系下培养CAR-T细胞,在第9天采用第流式细胞仪检测T细胞慢病毒转染率。2.细胞计数板CAR-T细胞数,绘制三种培养条件下CAR-T细胞生长曲线。3.CAR-T体外扩增后第10天,采用第流式细胞仪分别检测三组CAR-T记忆细胞表型。4.CAR-T体外扩增后第11天,CAR-T细胞与肿瘤细胞按效靶比(E:T)1:1共培养,流式细胞仪评估6h、24h后三组肿瘤细胞杀伤率的区别,ELISA法检测细胞因子释放情况.5.SPSS 21.0对实验数据进行统计分析、用Graphpad Prism8进行绘图.P<0.05为差异有统计学意义.结果1.CAR-T转染率上,三种培养方式无显著差别.2.细胞增殖上,Akti联合细胞因子培养的CAR-T较前两组有更强的扩增CAR-T细胞作用,IL-2组和Akti联合IL-2组无显著差异。3.记忆表型上,CD4+早期记忆细胞中,Akti联合细胞因子组的形成的早期记忆细胞比例显著高于前两组,而前两组无显著差异.CD8+早期记忆细胞中,Akti联合细胞因子组比例高于Akti组高于IL-2组.4.杀伤效果上,三组CAR-T细胞均强于对照T细胞组;Akti联合细胞因子组强于IL-2组但与Akti组无显著差异.结论本实验研究了在常规IL-2、Akti联合IL-2、Akti联合IL-2/7/15/21三种体系下培养的CAR-T细胞,以Akti联合混合细胞因子组在体外扩增、记忆表型的形成、细胞毒性作用上最佳.为后续提高CAR-T细胞免疫治疗临床作用提供实验基础.