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目的:肝细胞粘附分子(Hepatocyte cell adhesion molecule,HepaCAM)是近年来发现的一种肿瘤抑制因子,其在多种肿瘤组织中表现为下调或者缺失。Notch信号通路在包括前列腺癌(PCa)的多种肿瘤细胞中的活性明显增强。然而,在去势抵抗性前列腺癌中(Castration-resistant prostate cancer,CRPC),HepaCAM的表达情况及其作用尚不清楚。本项研究中,将探讨HepaCAM与Notch在CRPC的发生发展中的相互关系及作用机制。方法:1)收集重庆医科大学附属第一医院从2008年4月至2016年9月的CRPC组织标本和石蜡切片(共45例),同时收集配对的原发性PCa(Primary Prostate Ccancer,PPC)组织蜡块 41 例。免疫组织化学(IHC)检测其HepaCAM蛋白和Notch信号通路关键分子Notch1、Hes1的表达水平。统计分析HepaCAM和在配对的PPC和CRPC之间的表达差异;同时分析CRPC组织中HepaCAM与Notch1、Hes1表达的相关性,并回顾性分析CRPC及配对PPC组织中HepaCAM表达情况与临床病理病理数据之间的关系。2)将LNCaP细胞株分别用10μM的比卡鲁胺和10μM的恩杂鲁胺连续培养6个月,诱导成对比卡鲁胺抵抗的LNCaP(Bica-R)和对恩杂鲁胺抵抗的LNCaP(Enza-R)。Western blot检测人正常前列腺上皮细胞株 RWPE-1、LNCaP、Bica-R、Enza-R 细胞中 HepaCAM 的表达。HepaCAM过表达腺病毒载体分别转染DU145、LNCaP、Bica-R、Enza-R细胞,CCK-8及克隆形成实验观察细胞的增殖能力;划痕实验及Transwell实验检测细胞的侵袭能力。CCK-8实验比较过表达HepaCAM后,Enza-R细胞对恩杂鲁胺敏感性的改变。3)将LNCaP及Enza-R细胞分别用10nM的多西他赛连续培养6个月,诱导其分别成为对多西他赛抵抗的LNCaP(Doce-R)及对恩杂鲁胺和多西他赛序贯性双重抵抗的LNCaP(E+D-R细胞);RT-qPCR和Western blot 分别检测 LNCaP、Bica-R、Enza-R、Doce-R 及 E+D-R 细胞中Notch信号通路相关分子,诸如Jagged1、Notch1、NICD(蛋白水平)、Hes1的mRNA和蛋白表达水平;Western blot实验检测Ad-HepaCAM或/和PF-3084014处理Enza-R细胞后,上皮间质化(EMT)相关蛋白,如E-cadherin、N-cadherin和Snai1蛋白的表达情况。4)Ad-HepaCAM或/和PF-3084014处理Enza-R细胞。细胞免疫荧光实验检测Notch信号通路相关分子Notch1和Hes1的表达情况;RT-qPCR 检测 Enza-R 细胞中 Jagged1、Notch1 和 Hes1 的 mRNA 水平;Western blot 分别检测 Bica-R、Enza-R 细胞中 Jagged1、Notch1、NICD、Hes1的表达情况,并分析其表达差异。5)CCK-8实验分别检测经Ad-HepaCAM或/和PF-3084014处理后的Doce-R、E+D-R细胞及其亲代细胞对多西他赛抵抗性性的改变情况;CCK-8实验检测经Ad-HepaCAM处理后的Doce-R、E+D-R细胞的活性变化。6)CCK-8实验检测经Ad-HepaCAM和/或PF-3084014处理后的Enza-R细胞对恩杂鲁胺敏感性的变化;CCK-8实验检测经Ad-HepaCAM和/或PF-3084014处理Doce-R细胞对多西他赛敏感性的变化;CCK-8实验检测经Ad-HepaCAM和/或PF-3084014处理后的E+D-R细胞对多西他赛敏感性的变化。CCK-8实验检测经不同浓度的PF-3084014(5、10、20、30、40、60、80、、100μM)分别处理 Enza-R、Doce-R和E+D-R细胞后,细胞活性变化情况。结果:1)与配对的PPC组织相比,HepaCAM在CRPC组织中的表达明显降低或者丢失(P=0.0336);Hesl在CRPC组织中的表达明显上调(P=0.0237);而Notchl的表达在配对组织中无显著性差异(P=0.063)。在CRPC组织中,HepaCAM的表达与Notchl呈负相关(r=-0.652,P<0.01);与 Hesl 呈负相关(r=-0.442,P=0.02)。Western blot 实验结果显示在14例CRPC组织标本中,HepaCAM与Notchl(r=-0.572,P=0.033)、Hesl(r=-0.728,P=0.003)同样呈负相关关系。Kaplan-Meier 生存分析显示,在CRPC组织中,HepaCAM表达阴性的病人的中位无进展生存期(FPS)为27个月,而HepaCAM表达阳性的中位FPS为39个月,二者之间具有显著的统计学差异(P=0.039)。2)人正常前列腺上皮细胞RWPE-1中HepaCAM正常表达,而在Bica-R、Enza-R细胞中及其亲代细胞LNCaP中HepaCAM的表达呈阴性。CCK-8实验结果显示,Ad-HepaCAM显著地抑制DU145,LNCaP和CRPC细胞(Bica-R,Enza-R)的活性。克隆形成实验显示Ad-HepaCAM能够抑制CRPC细胞的增殖能力。Transwell和划痕实验结果显示,HepaCAM抑制CRPC细胞的迁移和侵袭能力。CCK-8实验结果显示,HepaCAM对Enza-R细胞对恩杂鲁胺的敏感性无明显改变。3)RT-qPCR和Western blot实验结果显示,与LNCaP细胞相比,在Bica-R、Enza-R、Doce-R及E+D-R细胞中,Notch信号通路相关分子包括Jaggedl,Notchl,NICD(蛋白水平),Hesl的表达水平显著升高。Ad-HepaCAM与PF-3084014对Enza-R细胞生长的抑制具有协同效应。HepaCAM能明显的上调E-cadherin,下调N-cadherin、Snail的表达,与PF-3084014合用时具有协同效应。4)免疫荧光实验结果显示,HepaCAM下调Notchl及Hesl的表达,PF-3084014显示了相似的结果,而二者联合时,其对Notchl及Hesl的下调更加明显。Western blot结果显示,HepaCAM与PF-3084014均能显著的降低Jaggedl、Notchl、NICD(蛋白水平)、Hesl的蛋白和mRNA水平,二者联用时具有协同效应。5)HepaCAM能够显著的抑制Doce-R、E+D-R细胞的增殖能力。HepaCAM与PF-3084014联用时,对E+D-R细胞的抑制作用明显增强。但是,HepaCAM对Doce-R及E+D-R细胞对多西他赛敏感性的改变无明显作用。6)PF-3084014部分逆转Enza-R、Doce-R及E+D-R细胞对恩杂鲁胺、多西他赛的抵抗性;与HepaCAM联用时,上述细胞对恩杂鲁胺、多西他赛的抵抗性无协同作用。当单独以20μM的PF-3084014处理细胞时,PF-3084014的抗肿瘤效应开始显现,其效应具有剂量依赖性。结论:1)在大部分CRPC组织中,,HepaCAM丢失而Notch1与Hes1的表达上调,它们之间存在。负相关关系。2)过表达HepaCAM通过下调Notc信号显著地抑制CRPC细胞的恶性生物学行为。3)过表达HepaCAM不能够逆转Enza-R对恩杂鲁胺的抵抗,同样也不能逆转Doce-R、E+D-R细胞对多西他赛的抵抗。4)PF-3084014部分逆转逆转Enza-R对恩杂鲁胺的抵抗以及Doce-R、E+D-R细胞对多西他赛的抵抗。