被子植物的双受精是指雄配子体中的一对精细胞分别与卵细胞和中央细胞融合生成胚及胚乳的有性生殖过程。人类在一百多年前发现了双受精现象,但至今未对其动态过程进行详实的观察和记录。受精活动中的一些重要的细节问题,比如卵细胞和中央细胞在融合精细胞时是否具有某种选择性等等,一直以来有待于得到确切的结论。本研究首先通过荧光标记拟南芥的精细胞核,实现了拟南芥受精过程的实时动态观察,掌握了双受精过程的细胞动态特征。在此基础上,我们进一步克隆了蓝猪耳精细胞特异性表达基因Tf-DUO1及其上游启动子序列,为在另外的被子植物中验证得到的实验结果奠定了实验基础。本研究取得的主要结果如下。　　基于前人已报导的实验方法,本研究首先在自己的实验室摸索建立了稳定、可重复的拟南芥半体内受精培养及观察体系。我们继而利用已知的拟南芥精细胞特异性表达基因的启动子序列信息及细胞核定位信号信息,构建了精细胞核定位的荧光蛋白融合基因,实现了拟南芥精细胞核的荧光标记和受精过程的实时动态观察记录。由于细胞核标记选用了波长可转换的荧光蛋白KikGR,本研究除观察了拟南芥受精的实时动态过程以外,还有效地区分了一对精细胞,分别记录了它们受精融合行为。　　通过追踪一对精细胞从进入胚囊到完成双受精融合的实时动态过程,我们完整地观察和记录了双受精的细胞动态特征。其中,精细胞从珠孔端进入胚珠到被释放于助细胞约历时15分钟到146分钟(n=18);被释放的精细胞静止0-10分钟后开始向融合的靶细胞移动(n=14);在被释放后5-30分钟内,精细胞完成与卵细胞的核融合(n=14);精细胞与中央细胞的核融合时间稍微滞后(12/14),约完成于被释放后的5-80分钟之间(n=12)。在我们观察个例中,拟南芥的双受精过程耗时(从精细胞释放到完成两次核融合)5-80分钟(n=14)。　　对KikGR标记的两个精细胞中的一个细胞单独进行405nm的光照射处理,可将该细胞细胞核的荧光转换为红色。利用这样的方法,我们对151个受精个例中的精细胞进行了分别标记并观察记录了它们的受精结果。当转换照射功率在0.0035-0.018mW,能量在21.88 x10-6J-200.67×10-6J范围内时:①精细胞与卵细胞和中央细胞的融合能力不受影响;②被405nm激光照射的精细胞与不受照射的精细胞与卵细胞和中央细胞的融合比率没有差别。该结果表明:拟南芥雄配子体中的一对精细胞之间不形成显著的细胞分化,两个精细胞中的任意一个均具备与卵细胞和中央细胞受精的能力,且受精的机率相等。　　为了调查上述实验结果在被子植物中的普遍性,我们拟用同样的方法研究蓝猪耳的双受精过程。我们通过兼并PCR、Tail-PCR和3＇RACE等体外克隆技术,从蓝猪耳基因组DNA巾克隆了精细胞特意表达基因(Tf-DUO1)及其上游启动子序列。序列分析结果表明,Tf-DUOl基因全长1712bp,包括三个外显子,两个内含子,蚩自全长为205个氨基酸。将Tf-DUOl转化拟南芥后可恢复拟南芥duo1的突变表型。目前,利用Tf-DUO1启动子序列进行蓝猪耳精细胞核KikGR标记的转基因载体己构建完成,转化实验尚在进行中。　　综上所述,本研究实现了拟南芥双受精过程的实时动态观察,证实了拟南芥一对精细胞之间不存在受精的偏向性选择,同时本研究为后续的实验观察准备了可靠的基础材料。