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萜类化合物是植物花香物质中最大的类群,不同品种的百合萜类物质挥发量存在很大差异。脱氧木酮糖-5-磷酸(DXP)途径是合成植物萜类化合物的途径之一,1-脱氧木酮糖-5-磷酸还原酶(DXR)是其关键性调控限速酶。已有研究证实可以通过启动子的选择来调控基因表达,使植物花香物质的合成被人为控制在植株的某一特定发育时期、某一特殊组织器官。因此,开展DXR启动子相关研究对明确该基因功能及其调控机制具有重要意义。
本实验通过hiTAIL-PCR技术,从“雪皇后”和“布鲁诺”百合花瓣基因组DNA中克隆得到LlDXR、LaDXR5端上游序列,并利用不同缺失片段的LIDXR5端上游序列构建特异启动子的植物表达载体,进行烟草的遗传转化研究其启动活性。研究结果如下:
1.从“铁炮”百合花瓣中扩增得到长度为1017bp的DXR5端上游序列,从“布鲁诺”百合花瓣中扩增得到长度为2767bp的DXR5端上游序列,利用在线软件预测分析,发现在LlDXR和LaDXR5端上游序列均具备启动子的基本元件和光应答顺式作用元件(如TATA-box、CAAT-box、G-box等)。LlDXR在-769bp～-672bp的位置存在预测的基础启动子序列和转录起始位点,LaDXR存在多个预测的基础启动子序列和转录起始位点,同时发现LlDXR启动子序列具备A-box、BoxⅢ、CCGTCC-box,而这些元件在LaDXR启动子序列中尚未发现。
2.扩增得到3个LlDXR启动子缺失片段,长度分别为969bp、767bp和534bp,分别替换植物表达载体pCAMBIA1300G质粒的CaMV35S启动子,与GUS基因融合表达,成功构建了含3个不同长度LlDXR启动子-GUS融合基因的植物表达载体,命名为pCAMBIA1300G-969、pCAMBIA1300G-767、pCAMBIA1300G-534。通过农杆菌介导,将融合基因植物表达载体转入烟草,筛选后通过PCR检测和GUS组织化学染色鉴定,证明LlDXR启动子-GUS融合基因整合进入受体细胞的基因组中,获得了阳性转基因烟草植株。
3.GUS染色和酶活测定结果表明,LlDXR启动子片段不能驱动GUS基因在烟草根、茎、叶中表达。在伤害诱导和茉莉酸甲酯诱导下,GUS基因均能得到表达,且伤害诱导下pCAMBIA1300G-969启动子片段驱动GUS基因表达的能力显著高于CaMV35S启动子驱动外源基因表达的能力,表现出强启动子的特征。
4.利用DXR抗体,进行免疫荧光定位发现,DXR在百合花瓣的表皮气孔器和维管束细胞有大量表达,亚细胞水平可能在花瓣细胞的质体中表达。