慢性髓系白血病(CML)是一种骨髓造血干细胞恶性克隆性疾病。病程进展慢,临床以发热、脾肿大、外周血及骨髓中出现大量中幼、晚幼粒细胞等为特征。该病病程分为慢性期、加速期以及急性变期,在病程进入急变期后,患者病情往往会出现迅速恶化,对药物反应差等特点。CML的分子发病机制现已基本阐明,即t(9；22)(q34；q11)染色体易位,这一改变导致了位于9q34断裂区的ABL与22q11断裂区的BCR形成BCR-ABL融合基因,后者具有异常活化的酪氨酸蛋白激酶活性,通过激活一些细胞关键调节蛋白的磷酸化和多种信号转导途径,如通过激活参与细胞增殖和分化调控的Ras-MAPK信号途径,使造血干细胞增殖凋亡失控和分化异常。由于这一致病机制的明确,针对抑制酪氨酸激酶异常活化的小分子靶向药物,如伊马替尼、达沙替尼等相继问世,使得CML患者的临床完全缓解率或部分缓解率有了很大的提高。但是,有相当一部分患者对于这些药物出现原发耐药,或者即使是药物敏感的患者,在维持治疗若干年后,最终会向加速期及急性变期转化,进而使得病情恶化,并出现多药耐药现象。因此,进一步深入探索CML病情进展的分子机制对于CML的多靶点治疗有着重要的意义。　　 miRNA与多种肿瘤的发生密切关系。miRNA的长度较短,因此获得性或缺失性的功能突变的积累发生较少,各种突变、启动子的超甲基化或扩增都很容易引起miRNA的激活或失活。miRNA通过调控tuRNA的转译或稳定性来参与正常细胞稳定状态的维持,因此miRNA的异常表达则可能导致其相应靶基因的异常。miRNA活性丧失使靶基因过表达,而miRNA激活则会导致靶基因下调,这些可能涉及细胞增殖、凋亡、侵袭和血管发生等过程。miRNA既可作为抑癌基因,下调原癌基因的活性,也可作为癌基因,下调抑癌基因的活性。不同的细胞中,同样的miRNA可能作为癌基因或抑癌基因,而且在某些特定的细胞中一个miRNA的靶基因往往不止一个,而每一个靶基因又可能受多个miRNA的调控,组成了错综复杂的调控网络,在转录后水平上对各种基因进行复杂的调控,参与肿瘤的发生发展。　　 miRNA与血液病的发生密切相关,研究表明miRNA-15和miRNA-1在某些类型的白血病和淋巴瘤中发生了功能障碍,miRNA-15和miRNA-16定位在染色体13q14区段,研究发现,65％的CLL患者携带miRNA-15和miRNA-16丢失或突变的癌细胞。慢性淋巴性白血病、多发性骨髓瘤、套细胞淋巴瘤和前列腺癌中也常有该区段的丢失。这两种miRNA通过抑制Bcl-2蛋白的表达调节细胞凋亡过程,Bcl-2蛋白主要通过作用于线粒体来实现其抑制凋亡的生物学活性,因此当miRNA-15和miRNA-16丢失或突变时,Bcl-2蛋白的表达量上调,细胞凋亡受阻,最终导致肿瘤发生。　　 miRNA在CML的进展中也有重要作用。在对CML患者和正常人的单个核细胞及CD34+细胞的157个miRNA进行检测发现:miRNA-10a、miRNA-150及miRNA-151在CML患者体内表达下降,而miRNA-96表达则增高。而在对正常人CD34+细胞和CML患者CD34+细胞进行比较发现,CML慢性期miRNA-17-92家族过表达,而急变期无过表达。约95％以上CML患者有ph染色体,其结果是在分子水平上形成BCR-ABL融合基因。也有研究表明BCR-ABL融合基因的表达也受到相关miRNA的影响,如miRNA-17-92、miRNA-203等。　　 本研究分别以CML初发患者及CML急性变患者的骨髓原代细胞为研究对象,分别提取两者的总RNA后,首先进行小RNA的富集,将收集到的小RNA分离后分别加poly(A)尾和5’接头,然后将连有接头及poly(A)尾的片段进行逆转录,所得到的初发患者及急性变患者的cDNA进行本研究所自行发明的柱式消减杂交,首先将CML初发患者骨髓原代细胞中克隆的片段与尼龙膜结合,然后将CML急性变患者骨髓原代细胞克隆的片段与之进行杂交,最后得到的片段则为CML急性变患者骨髓原代细胞所特有的片段。将这些特有的片段扩增后做转化,然后测序检测克隆到的小RNA序列。　　 本实验中共随机选取50个阳性克隆进行测序,获得测序结果后对获得的克隆序列进行分析,结果显示共有42个克隆条序列因重复或长度不在miRNA理论范围内,剩余的8条序列长度在18-25bp之间,因此,可将这8条序列暂定为候选miRNA序列,暂命名为micro-A、micro-B、micro-C、micro-D、micro-E、micro-F、micro-G及micro-H。随后进行相关验证,以确定这8条序列是否为CML急性变患者骨髓原代细胞中所特有的miRNA序列。　　 目前对确定某小RNA是否为miRNA的标准首先是预测小RNA的前体是否具有典型的发夹结构,且小RNA是否处于发卡结构的臂上,其次还需要对其进行表达的分析,若小RNA序列能在相应的物种中表达,就可以判定此小RNA序列为miRNA序列。本研究中,首先对CML急性变患者骨髓原代细胞中克隆的8条候选miRNA进行了生物信息学分析,这8条序列都可在Genebank中找到各自的同源序列,并且经过在miRNA数据库中比对,排除已知序列后显示这8条序列均为未知序列,再经过二级结构预测软件分析后表明,8条序列中的micro-B、micro-C、micro-D、micro-E、micro-F、micro-G及micro-H七条序列分别处于茎环结构的茎环上,而micro-A序列则位于茎环结构的臂上。因此,经过第一步的生物信息学分析判定micro-A是CML急性变患者骨髓原代细胞中特异的miRNA,而另7条则不是。　　 对于初步判定的micro-A还需进一步检测其表达情况来最后确定其是否为CML急性变患者骨髓原代细胞特异的miRNA。为了验证micro-A的表达,我们采用总RNA加poly(A)尾RT-PCR法检测这条序列在CML急性变患者骨髓原代细胞的表达情况,结果显示该序列可表达。同时为了探明micro-A在CML初发患者骨髓原代细胞中是否也表达,我们同样做了CML初发患者骨髓原代细胞总RNA加poly(A)尾RT-PCR法的验证,结果没检测到micro-A在CML初发患者骨髓原代细胞中的表达情况。因此,经过序列分析及实验验证后,本研究最后获得一条CML急性变患者骨髓原代细胞所特有的miRNA,即micro-A。　　 在今后的研究中,我们要对本研究中所克隆得到的miRNA做进一步的功能研究,以揭示其与CML发生的关系及其在CML中的表达特征和功能意义,阐明CML中的RNA调控机制,使我们对CML急性变的病因及分子机制得到深入的认识,并发现以RNA分子为对象的治疗靶标和早期诊断标识,为肿瘤等重大疾病的防治提供新的思路和方法。