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钙离子/钙调蛋白(Ca2+/Camodulin,Ca2+/CaM)信号参与外周组织器官的免疫和炎症过程,其中Ca2+/CaM依赖性蛋白激酶IV(CaMKIV)是细胞内钙信号激活的下游关键分子之一,有助于启动钙信号相关转录反应。CaMKIV能调节淋巴细胞活性和功能、影响外周组织炎症过程。此外,CaMKIV是调节肌肉基因表达、辅助肌再生重塑的关键分子。CaM/CaMKIV信号是否直接干预肌损伤后炎症反应,尚缺乏文献报道。
目的:
1.分析损伤肌组织内CaM、CaMKIV活性改变;
2.探讨CaM、CaMKIV对肌内炎症及肌纤维免疫特性的影响。
方法:
1.胫骨前肌(TA)注射Cardiotoxin(CTX)诱导B6小鼠急性肌损伤;干扰小鼠体内CaM水平(腹腔注射CaM抑制剂R24571,或激动剂CALPl),或CaMKIV水平(腹腔注射CaMKIV纯化蛋白,或其拮抗剂KN-93)。
2.ELISA检测损伤肌PDEI(磷酸二酯酶1)浓度、免疫印迹(WB)检测CaM和CaMKIV水平、qRT-PCR及WB分析肌自身抗原(Mi-2,HRS和Ku-70)和TLR3mRNA与蛋白水平:免疫荧光观察损伤肌内淋巴细胞浸润、再生肌纤维MHC表达;FACS检测损伤肌内CD45+细胞渗出程度及促炎的F4/80+Ly-6C+巨噬细胞比例;qPCR确定细胞因子/趋化因子水平。
3.C2C12细胞复苏培养,马血清分化,IFN-γ处理。添加R24571或CALP1以调整细胞培养体系中CaM水平;采用特定ShRNA敲除C2C12细胞CaMKIV基因,马血清分化并采用IFN-γ处理。48h后收集细胞,qRT-PCR或WB分析增殖成肌细胞/分化肌纤维的MHC、TLRs的表达。
结果:
1.CTX肌内注射可成功诱导小鼠急性肌损伤:损伤TA肌内CaM水平显著上调;R24571及CALPI腹腔注射将导致肌组织PDE1和CaM水平改变。
2.较之对照小鼠,采用CALP1上调CaM水平,或经纯化蛋白上调体内CaMKIV活性时,将触发更为严重的肌内单核/巨噬细胞浸润、促炎巨噬细胞(M1)比例增加;并上调损伤肌自身抗原、TLR3、特征性促炎细胞因子/趋化因子水平;亦可见肌内T细胞浸润增加、部分再生肌纤维呈现MHC-Ⅰ分子H-2Kb、MHC-Ⅱ分子H2-Ea阳性表达。R24571和KN-93处理则导致对肌内炎症反应的抑制。
3.体外条件下,R24571干预,或CaMKIV基因沉默,将显著下调IFN--诱导的C2C12成肌细胞/分化肌管免疫分子(H-2Kb,H2-Ea和TLR3)表达水平。
结论:
急性损伤骨骼肌组织中,CaM、CaMKIV表达上调。CaM-CaMKIV信号的持续活化可能加重肌内炎症,影响损伤肌组织再生。
目的:
1.分析损伤肌组织内CaM、CaMKIV活性改变;
2.探讨CaM、CaMKIV对肌内炎症及肌纤维免疫特性的影响。
方法:
1.胫骨前肌(TA)注射Cardiotoxin(CTX)诱导B6小鼠急性肌损伤;干扰小鼠体内CaM水平(腹腔注射CaM抑制剂R24571,或激动剂CALPl),或CaMKIV水平(腹腔注射CaMKIV纯化蛋白,或其拮抗剂KN-93)。
2.ELISA检测损伤肌PDEI(磷酸二酯酶1)浓度、免疫印迹(WB)检测CaM和CaMKIV水平、qRT-PCR及WB分析肌自身抗原(Mi-2,HRS和Ku-70)和TLR3mRNA与蛋白水平:免疫荧光观察损伤肌内淋巴细胞浸润、再生肌纤维MHC表达;FACS检测损伤肌内CD45+细胞渗出程度及促炎的F4/80+Ly-6C+巨噬细胞比例;qPCR确定细胞因子/趋化因子水平。
3.C2C12细胞复苏培养,马血清分化,IFN-γ处理。添加R24571或CALP1以调整细胞培养体系中CaM水平;采用特定ShRNA敲除C2C12细胞CaMKIV基因,马血清分化并采用IFN-γ处理。48h后收集细胞,qRT-PCR或WB分析增殖成肌细胞/分化肌纤维的MHC、TLRs的表达。
结果:
1.CTX肌内注射可成功诱导小鼠急性肌损伤:损伤TA肌内CaM水平显著上调;R24571及CALPI腹腔注射将导致肌组织PDE1和CaM水平改变。
2.较之对照小鼠,采用CALP1上调CaM水平,或经纯化蛋白上调体内CaMKIV活性时,将触发更为严重的肌内单核/巨噬细胞浸润、促炎巨噬细胞(M1)比例增加;并上调损伤肌自身抗原、TLR3、特征性促炎细胞因子/趋化因子水平;亦可见肌内T细胞浸润增加、部分再生肌纤维呈现MHC-Ⅰ分子H-2Kb、MHC-Ⅱ分子H2-Ea阳性表达。R24571和KN-93处理则导致对肌内炎症反应的抑制。
3.体外条件下,R24571干预,或CaMKIV基因沉默,将显著下调IFN--诱导的C2C12成肌细胞/分化肌管免疫分子(H-2Kb,H2-Ea和TLR3)表达水平。
结论:
急性损伤骨骼肌组织中,CaM、CaMKIV表达上调。CaM-CaMKIV信号的持续活化可能加重肌内炎症,影响损伤肌组织再生。