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神经病理性疼痛涵盖由神经系统的损伤或疾病引起的不同的多种躯体感觉异常，如感觉迟钝，异常性疼痛和痛觉过敏。目前全世界多达7％的人群罹患神经病理性疼痛的折磨，给他们带来巨大的痛苦。褪黑素是一种生物节律相关激素，曾被广泛报道具有抗氧化和抗炎的作用。虽然褪黑素在各类一般的急慢性疼痛模型的研究中被证实具有显著的镇痛作用，但褪黑素对经典神经病理性疼痛模型的神经性疼痛的镇痛效果是有争议的：在小鼠的脊神经结扎模型(Spinal nerve ligation, SNL)上应用褪黑素可以减少模型小鼠的热痛觉过敏，但对其机械性异常性疼痛没有显著改善；而褪黑素在慢性压迫损伤模型(Chronic constriction injury, CCI)中仅有改善机械性异常性疼痛的效果。这些矛盾的研究结果的可来源于经典神经病理性疼痛模型的各自特征：SNL模型因创伤大、容易暴露于感染并且损伤经常导致严重的运动缺陷对于实验结果影响大；CCI模型所产生的异常疼痛的程度受到单次实验结扎操作手法的影响大，导致处理的模型动物之间存在显著的个体差异。
虽然在过去的一般的急慢性疼痛模型的研究中曾证明，中枢神经系统中的褪黑素膜受体对于褪黑素介导的镇痛作用发挥着重要的作用，但是他们具体的作用机制、以及他们的特异性褪黑素膜受体定位特点尚不清楚。历来的神经病理性疼痛研究都强调外周神经系统(例如背根神经节)的损伤和病变对于神经病理性疼痛的发生发展尤为重要：损伤外周传入神经纤维将导致背根神经节中疼痛感受神经元的兴奋性增强，诱发疼痛感受神经元频频自发放电兴奋，并且导致上行投射区域的中枢神经系统的敏感性增强，最终导致异常疼痛的出现；临床上针对背根神经节的区域药物阻滞或电刺激治疗方法都可以明显改善神经病理性疼痛的疼痛强度，并且还能回避由于刺激中枢神经系统所导致的副作用。值得注意的是，对于背根神经节神经元的全细胞膜片钳和细胞内自由钙fura-2染色的研究曾报道到：褪黑素能够显著地抑制钙离子电压门控通道，从而减少细胞内游离自由钙离子的水平，提示褪黑素对于背根神经节确有具有重要的调控作用。基于上述这些结果，我们推定在背根神经节神经元上可能有褪黑素经典膜受体的存在，并且可能对于神经病理性疼痛的治疗有潜在的治疗效果，因此我们提出我们的实验计划：1.我们将验证褪黑素经典膜受体在背根神经节神经元上的表达，并且使用最新的神经袖套模型重新评估褪黑素的神经病理性疼痛上的镇痛效果，并且验证疼痛相关反应的改变；2.我们将建立原代培养的背根神经节神经元细胞系，并利用转录组基因芯片检测、验证褪黑素对于背根神经节神经元的作用机制和通路。
第一部分：褪黑素膜受体MT1和MT2在小鼠背根神经节和脊髓中的表达定位
目的：验证褪黑素膜受体1型和2型(melatonin receptor 1/2, MT1/2)在小鼠背根神经节和脊髓中的表达定位。
方法：分别使用免疫组化和免疫荧光双标染色确定背根神经节和脊髓中的褪黑素膜受体MT1和MT2的表达定位。
结果：褪黑素膜受体MT1和MT2都广泛表达在腰段脊髓的前后角的神经元上，两者表达没有显著的差别，但褪黑素膜受体MT1和MT2在背根神经节上的表达特点不同：褪黑素膜受体MT1主要表达胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)阳性的背根神经节的卫星胶质细胞，而褪黑素膜受体MT2主要表达在NeuN阳性的背根神经节的神经元上。褪黑素膜受体MT2高表达的背根神经节神经元主要是中小型肽能降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)阳性和非肽能植物凝集素B4型(isolectin B4,IB4)阳性的疼痛感受神经元。
结论：背根神经节中神经元特异表达的褪黑素膜受体MT2和疼痛感受通路密切相关。
第二部分：褪黑素膜受体MT1和MT2在小鼠神经袖套模型中的镇痛作用研究
目的：探究褪黑素膜受体MT1和MT2在小鼠神经袖套模型中的镇痛作用。
方法：使用C57BL/6J小鼠构建坐骨神经袖套模型，设立实验分组给与褪黑素及其受体激动剂、阻断剂的组合的干预，并在术后多个时间点进行疼痛行为学评测。同时收集术侧的背根神经节和脊髓背角进行蛋白印迹实验和酶联免疫吸附实验实验，以检测疼痛信号反应的相关指示物的表达情况。
结果：使用褪黑素或者褪黑素膜受体MT2的特异性激动剂8-甲氧基-2-丙酰胺基四氢化萘(8-methoxy-2-propionamidotetralin, 8MP)干预处理都可以显著抑制由于坐骨神经袖套植入所导致的热痛过敏和机械系异常疼痛，但是激动褪黑素膜受体MT1对于坐骨神经袖套模型的神经病理性疼痛表现没有明显改善。同时，褪黑素和8MP还都抑制了背根神经节中损伤快速反应蛋白c-fos和疼痛递质CGRP的表达上调，也抑制了背根神经节内神经炎症因子肿瘤坏死因子-1α(tumornecrosisfactor-1α,TNF-1α)和白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)的水平的上调。
结论：抑制背根神经节神经元上的褪黑素膜受体MT2可以明显抑制由神经袖套植入所导致的疼痛行为和反应。
第三部分：褪黑素膜受体MT2在背根神经节神经元中的疼痛调控信号通路
目的：探究背根神经节神经元上褪黑素膜受体MT2所介导的疼痛信号机制。
方法：构建原代培养背根神经节神经元系，使用100μM褪黑素膜受体MT2的特异性激动剂8MP孵育并且收集RNA进行转录组基因芯片检测和生物信息分析，并且依据结果使用蛋白印迹实验和实时定量反转PCR实验进行验证和分析褪黑素膜受体MT2的关键信号调控节点，并且使用特异性小分子干扰脱氧核糖核酸(Small interfering RNA,siRNA)和特异性激动剂/阻断剂进行干涉实验验证信号通路的上下游关系。
结果：转录组基因芯片分析证实使用8MP激活褪黑素膜受体MT2可以显著抑制细胞内多种钙信号调控通路(Cacna1b、Cacna1e、Grm1、Grin2a等)和丝裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族信号通路(MAPK1、MAPK3、MAPK5、MAPK7、MAPK9、MAPK10、MAPK11等)。验证实验证实8MP激活褪黑素膜受体MT2可以显著抑制MAPK1、Cacna1b、Cacna1e、Grm1、Grin2a的基因和蛋白表达水平，并且使用MAPK1特异性siRNA抑制MAPK1可以抑制Cacna1b、Cacna1e、Grm1、Grin2a的基因和蛋白表达水平，而反之无效。并且高浓度褪黑素所激活的褪黑素核受体RAR相关的孤儿受体α型(RARrelatedorphanreceptorα,RORα)可以显著抑制MAPK1-钙调控信号通路。
结论：在背根神经节神经元中，褪黑素镇痛相关的MAPK1-钙调控信号通路是属于褪黑素膜受体MT2依赖通路，并且在高浓度褪黑素作用下受到来自细胞核受体RORα的负反馈抑制。
第四部分：高浓度褪黑素在背根神经节神经元中非受体依赖镇痛通路
目的：探究背根神经节神经元上受体非依赖镇痛通路。
方法：构建原代培养背根神经节神经元细胞系，使用1mM高浓度褪黑素孵育并且收集RNA进行转录组基因芯片检测和生物信息分析，并且依据结果进行蛋白印迹实验和实时定量反转PCR实验验证和分析。
结果：转录组基因芯片分析证实：使用1mM高浓度褪黑素孵育背根神经节神经元，可以明显调控背根神经节神经元的P2rx7、NOS1、Ednrb、Adrb2等多种重要的疼痛相关基因的表达水平。验证实验证实褪黑素抑制NOS1的基因和蛋白表达并不受褪黑素膜受体阻断(100μMluzindole)或者褪黑素核受体调控(200μMML-176或200μMCGP52608)的影响。
结论：在背根神经节神经元中的NOS1是褪黑素非受体依赖的镇痛通路的重要靶点。
虽然在过去的一般的急慢性疼痛模型的研究中曾证明，中枢神经系统中的褪黑素膜受体对于褪黑素介导的镇痛作用发挥着重要的作用，但是他们具体的作用机制、以及他们的特异性褪黑素膜受体定位特点尚不清楚。历来的神经病理性疼痛研究都强调外周神经系统(例如背根神经节)的损伤和病变对于神经病理性疼痛的发生发展尤为重要：损伤外周传入神经纤维将导致背根神经节中疼痛感受神经元的兴奋性增强，诱发疼痛感受神经元频频自发放电兴奋，并且导致上行投射区域的中枢神经系统的敏感性增强，最终导致异常疼痛的出现；临床上针对背根神经节的区域药物阻滞或电刺激治疗方法都可以明显改善神经病理性疼痛的疼痛强度，并且还能回避由于刺激中枢神经系统所导致的副作用。值得注意的是，对于背根神经节神经元的全细胞膜片钳和细胞内自由钙fura-2染色的研究曾报道到：褪黑素能够显著地抑制钙离子电压门控通道，从而减少细胞内游离自由钙离子的水平，提示褪黑素对于背根神经节确有具有重要的调控作用。基于上述这些结果，我们推定在背根神经节神经元上可能有褪黑素经典膜受体的存在，并且可能对于神经病理性疼痛的治疗有潜在的治疗效果，因此我们提出我们的实验计划：1.我们将验证褪黑素经典膜受体在背根神经节神经元上的表达，并且使用最新的神经袖套模型重新评估褪黑素的神经病理性疼痛上的镇痛效果，并且验证疼痛相关反应的改变；2.我们将建立原代培养的背根神经节神经元细胞系，并利用转录组基因芯片检测、验证褪黑素对于背根神经节神经元的作用机制和通路。
第一部分：褪黑素膜受体MT1和MT2在小鼠背根神经节和脊髓中的表达定位
目的：验证褪黑素膜受体1型和2型(melatonin receptor 1/2, MT1/2)在小鼠背根神经节和脊髓中的表达定位。
方法：分别使用免疫组化和免疫荧光双标染色确定背根神经节和脊髓中的褪黑素膜受体MT1和MT2的表达定位。
结果：褪黑素膜受体MT1和MT2都广泛表达在腰段脊髓的前后角的神经元上，两者表达没有显著的差别，但褪黑素膜受体MT1和MT2在背根神经节上的表达特点不同：褪黑素膜受体MT1主要表达胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)阳性的背根神经节的卫星胶质细胞，而褪黑素膜受体MT2主要表达在NeuN阳性的背根神经节的神经元上。褪黑素膜受体MT2高表达的背根神经节神经元主要是中小型肽能降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)阳性和非肽能植物凝集素B4型(isolectin B4,IB4)阳性的疼痛感受神经元。
结论：背根神经节中神经元特异表达的褪黑素膜受体MT2和疼痛感受通路密切相关。
第二部分：褪黑素膜受体MT1和MT2在小鼠神经袖套模型中的镇痛作用研究
目的：探究褪黑素膜受体MT1和MT2在小鼠神经袖套模型中的镇痛作用。
方法：使用C57BL/6J小鼠构建坐骨神经袖套模型，设立实验分组给与褪黑素及其受体激动剂、阻断剂的组合的干预，并在术后多个时间点进行疼痛行为学评测。同时收集术侧的背根神经节和脊髓背角进行蛋白印迹实验和酶联免疫吸附实验实验，以检测疼痛信号反应的相关指示物的表达情况。
结果：使用褪黑素或者褪黑素膜受体MT2的特异性激动剂8-甲氧基-2-丙酰胺基四氢化萘(8-methoxy-2-propionamidotetralin, 8MP)干预处理都可以显著抑制由于坐骨神经袖套植入所导致的热痛过敏和机械系异常疼痛，但是激动褪黑素膜受体MT1对于坐骨神经袖套模型的神经病理性疼痛表现没有明显改善。同时，褪黑素和8MP还都抑制了背根神经节中损伤快速反应蛋白c-fos和疼痛递质CGRP的表达上调，也抑制了背根神经节内神经炎症因子肿瘤坏死因子-1α(tumornecrosisfactor-1α,TNF-1α)和白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)的水平的上调。
结论：抑制背根神经节神经元上的褪黑素膜受体MT2可以明显抑制由神经袖套植入所导致的疼痛行为和反应。
第三部分：褪黑素膜受体MT2在背根神经节神经元中的疼痛调控信号通路
目的：探究背根神经节神经元上褪黑素膜受体MT2所介导的疼痛信号机制。
方法：构建原代培养背根神经节神经元系，使用100μM褪黑素膜受体MT2的特异性激动剂8MP孵育并且收集RNA进行转录组基因芯片检测和生物信息分析，并且依据结果使用蛋白印迹实验和实时定量反转PCR实验进行验证和分析褪黑素膜受体MT2的关键信号调控节点，并且使用特异性小分子干扰脱氧核糖核酸(Small interfering RNA,siRNA)和特异性激动剂/阻断剂进行干涉实验验证信号通路的上下游关系。
结果：转录组基因芯片分析证实使用8MP激活褪黑素膜受体MT2可以显著抑制细胞内多种钙信号调控通路(Cacna1b、Cacna1e、Grm1、Grin2a等)和丝裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族信号通路(MAPK1、MAPK3、MAPK5、MAPK7、MAPK9、MAPK10、MAPK11等)。验证实验证实8MP激活褪黑素膜受体MT2可以显著抑制MAPK1、Cacna1b、Cacna1e、Grm1、Grin2a的基因和蛋白表达水平，并且使用MAPK1特异性siRNA抑制MAPK1可以抑制Cacna1b、Cacna1e、Grm1、Grin2a的基因和蛋白表达水平，而反之无效。并且高浓度褪黑素所激活的褪黑素核受体RAR相关的孤儿受体α型(RARrelatedorphanreceptorα,RORα)可以显著抑制MAPK1-钙调控信号通路。
结论：在背根神经节神经元中，褪黑素镇痛相关的MAPK1-钙调控信号通路是属于褪黑素膜受体MT2依赖通路，并且在高浓度褪黑素作用下受到来自细胞核受体RORα的负反馈抑制。
第四部分：高浓度褪黑素在背根神经节神经元中非受体依赖镇痛通路
目的：探究背根神经节神经元上受体非依赖镇痛通路。
方法：构建原代培养背根神经节神经元细胞系，使用1mM高浓度褪黑素孵育并且收集RNA进行转录组基因芯片检测和生物信息分析，并且依据结果进行蛋白印迹实验和实时定量反转PCR实验验证和分析。
结果：转录组基因芯片分析证实：使用1mM高浓度褪黑素孵育背根神经节神经元，可以明显调控背根神经节神经元的P2rx7、NOS1、Ednrb、Adrb2等多种重要的疼痛相关基因的表达水平。验证实验证实褪黑素抑制NOS1的基因和蛋白表达并不受褪黑素膜受体阻断(100μMluzindole)或者褪黑素核受体调控(200μMML-176或200μMCGP52608)的影响。
结论：在背根神经节神经元中的NOS1是褪黑素非受体依赖的镇痛通路的重要靶点。