筛胸梳爪叩甲(Melanotus cribricollis)幼虫,俗称“金针虫”,是中国南方竹林地最为重要的笋期害虫,监测及防控难度大。平沙绿僵菌(Metarhizum pingshaense)WP08菌株是筛胸梳爪叩甲僵虫上分离的一种高毒力的昆虫致病真菌,可能突破竹林金针虫的生物防治瓶颈。然而,关于地下植食性昆虫与和虫生真菌互作的分子机制研究罕见报道。本文以筛胸梳爪叩甲幼虫和平沙绿僵菌WP08菌株为研究对象,探索绿僵菌侵染筛胸梳爪叩甲幼虫后保护酶系统应答反应,同时利用新一代高通量测序技术,对筛胸梳爪叩甲幼虫和平沙绿僵菌WP08菌株转录组水平的遗传背景开展研究,并挖掘昆虫免疫基因和绿僵菌毒致病基因。研究主要取得以下成果:(1)测定了平沙绿僵菌WP08菌株、金龟子绿僵菌(M.anisopliae)WTKH菌株及蝗绿僵菌(M.acridum)3株绿僵菌在不同孢子浓度条件下对筛胸梳爪叩甲幼虫的致病力,同时测定了不同侵染时期金针虫超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)及过氧化氢酶(CAT)3种保护酶含量及活力变化情况。结果表明,3株绿僵菌对筛胸梳爪叩甲幼虫均具有致死性,平沙绿僵菌WP08菌株最优,金龟子绿僵菌WTKH菌株次之,蝗绿僵菌最低。不同绿僵菌菌株的致病力随着浓度的增加而提高,WP08在1.3×108孢子.g-1干土浓度条件下的致病效果最好,仅在16d时供试金针虫已经全部死亡,但与1.3×107孢子.g-1干土浓度条件下的致病效果无显著差异,与1.3×106孢子.g-1干土的浓度条件下的致病效果差异显著。筛胸梳爪叩甲幼虫感染平沙绿僵菌后3种保护酶活性的变化趋势不同,SOD在不同侵染时期其活性变化无显著差异,而POD和CAT酶活性变化均表现为先下降后上升再下降的趋势。由此可知,平沙绿僵菌WP08对筛胸梳爪叩甲幼虫的致病性显著优于金龟子绿僵菌WTKH菌株和蝗绿僵菌,可作为林间应用的首选菌株。绿僵菌侵染可能对筛胸梳爪叩甲幼虫体内POD和CAT的活性产生的影响较SOD明显。(2)运用RNA-Seq技术,对接染平沙绿僵菌WP08菌株不同时间(CK、1 d、3 d、4 d、5 d、7 d)的筛胸梳爪叩甲幼虫进行测序,共获得近800M的高质量的Reads,组装拼接获得约64000个Unigene,各组样品与Unigene库的比对效果也较理想(>80%),同时与NCBI-Nr、Swiss-Prot、KEGG、COG、KOG、GO和Pfam数据库比对,获得40%Unigene功能注释率。筛胸梳爪叩甲与黑腹果蝇、赤拟谷盗和山松大小蠹的氨基酸序列比对,获得9512个同源基因cluster,4145个单拷贝基因Cluster。运用RNA-Seq技术对接染筛胸梳爪叩甲幼虫不同时间的平沙绿僵菌WP08菌株进行测序,共获得约134M的高质量的Reads,28107个Unigene和70%的注释率。平沙绿僵菌WP08菌株与烟曲霉、玉蜀黍黑粉菌、稻瘟病菌、尖孢镰刀菌和新型隐球菌氨基酸序列比对,获得9189个同源基因Cluster,1703个单拷贝基因的Cluster。同时,分别对两个物种的Unigene进行CDs预测,AS、SSR和SNP分析。(3)统计分析筛胸梳爪叩甲幼虫不同感染时期差异表达基因(DEGs)的数量、功能注释、GO富集、Pathway富集和免疫相关基因。筛胸梳爪叩甲幼虫的DEGs的数量随着侵染时间整体呈上升趋势,免疫相关通路和“生物学过程”GO term的种类和数量也逐渐增加。部分基因在不同的侵染时间具有特异性,参与不同的通路和GO terms,但大部分基因在不同阶段普遍存在。筛胸梳爪叩甲幼虫Unigene库中与昆虫免疫防御相关的部分基因亦被挖掘,包括GNBP、β-1,3-GRP、PGRP、lysozyme、GST、P450、SDR等。另一方面,将平沙绿僵菌WP08菌株氨基酸序列与PHI数据库比对,以发掘昆虫病原真菌的毒力基因。PHI比对共获得1529个已被验证的基因注释结果,其中35个基因注释的参考菌株为绿僵菌和白僵菌,包括BbbqrA、BbCHIT1、Chi2、CYP52X1、Kre2、Mnt1、Ktr1、Ktr4、MaSnf1、Pr1、OpS1、mrGAT、MrpacC、Ohmm、Fkh2、MBZ1、mas5、mhk1、Bck1、Fus3、Mkk1/2、Slt2、Ste11、Ste7、Hog1、Pbs2、Ssk2、ras3、vosA和wetA等基因,通过对昆虫体壁降解、氧化还原、碳源利用、磷酸化、转录因子调控、细胞周期、渗透压调节、生长发育等各方面调控致病菌株的多重胁迫抗性和致病力。本研究通过从生理和分子水平初步探究虫-菌的互作机理,不仅为昆虫免疫机制的研究提供关键信息和理论支持,同时也为高效生防菌株的基因改造奠定基础,有利于害虫生物防控技术的发展。