表皮生长因子（epidermal growth factor,缩写EGF）,是一强有力的细胞分裂因子,主要由颌下腺管细胞分泌。EGF对上皮细胞有促增殖作用,外源性EGF在临床中的应用开始于创伤治疗方面:如体表创伤、溃疡,角膜损伤等。由于人体大多数的EGF存在于消化道,远远高于循环中的EGF浓度,因此,EGF对消化道黏膜有效的保护作用使外源性EGF用于消化道疾病治疗成为了一个研究热点。研究同时也发现EGF和EGF受体（EGFR）拮抗剂可以影响肿瘤的发生、发展和消退,因此在临床中EGF的应用由于它潜在的安全性问题而受到了制约。由于EGF与EGFR激活及其信号转导通路十分复杂,病理生理功能多样,而Bcl-2、p53基因蛋白表达异常与肿瘤发生、发展有关,故迫切需要进一步研究它们在基础研究和临床实践中的地位。本实验首先检测不同浓度EGF在不同时间段对人胚胎羊膜细胞FL的促增殖作用,进一步检测不同浓度EGF与激活Ras/Raf/MEK/ERK信号通路的时效关系以及对Bcl-2、p53蛋白表达的影响,为整体动物实验提供EGF应用的理论依据和实验数据。目前在临床中已经被采用的EGF外用材料主要来源于基因工程合成或小鼠颌下腺提取,价格十分昂贵,而且来源非常有限,这是制约EGF应用于临床的另一个重要原因。如果不能解决这个问题,即使研究阐明了EGF治疗的信号转导机制并证明其在临床实践中的积极意义,也无法赋予这项研究的现实的理论意义和应用价值。这是使得基础研究的成果具有应用可行性的最基本条件。联系我国目前的实际情况,如能简便,价廉地从家畜腺体提取到有生物学活性的EGF将是一件利国利民的好事。而同时我国每年又有大量的牲畜颌下腺被废弃,因此原材料来源丰富且成本低廉,并且作为重要的经济动物,羊类制品为人类接受程度高,这些都为EGF广阔的应用前景提供了最基本的保障。本论文的内容分以下两个部分:第一部分:外源性EGF促FL细胞增殖作用的信号转导机制及其安全性评价研究目的探讨EGF促FL细胞增殖时激活Ras/Raf/MEK/ERK信号转导通路时间-剂量-效应关系及对Bcl-2、p53蛋白表达的影响。材料与方法1.MTT法检测细胞增殖:细胞以2×10⁸/L的密度接种于96孔板上,每孔100μ1。待细胞贴璧生长后换含不同浓度rhEGF（0.1、1、10、30、60μg/L）的无血清培养基继续培养,对照孔以生理盐水代替rhEGF。观察细胞生长形态学变化并分别在第1、2、3、4、5 d取样;或换含rhEGF（10μg/L）+不同浓度PD98059（25、50、75μmol/L）的MEM培养基100μ1,继续培养48 h。取样后每孔加入MTT 20μ1,孵育4 h后弃上清,每孔加150μ1 DMSO,振荡10 min,于酶标仪490 nm波长下测定各孔的吸光度A值。细胞增殖率=（实验组A值-对照组A值）/对照组A值×100%。2.Western蛋白印迹法检测Ras/Raf/MEK/ERK通路及Bcl-2、p53蛋白水平:待细胞贴璧生长后换用rhEGF终浓度为1、10、60μg/L无血清的MEM培养基继续培养:测定MAPK通路抑制剂PD98059的影响则分别加入终浓度为25,50,75μmol/L的PD98059,预处理1 h。实验开始后根据需要在不同时段用胰酶消化,收集细胞并加细胞裂解液,取上清液,Bradford法测蛋白浓度。每孔加50μg的蛋白样品电泳,电泳结束后转PVDF膜,将转有蛋白的膜置于5%BSA封闭,经一抗和HRP标记的二抗处理后,在暗室,取ECL发光试剂A、B液各1 ml,混合后覆盖于膜上1.5 min,最后用X光胶片进行曝光、显影及定影。结果1.FL细胞经培养48小时后,生理盐水对照组基本以多边形居多,而加入rhEGF后细胞以长条纺锤形居多。2.第1-5天中,1-60μg/L浓度组促细胞增殖率明显增高（P＜0.01）。rhEGF浓度10μg/L第3天时达到最高（42.4%,P＜0.01）,第4、5天后1-60μg/L浓度组促细胞增殖率开始下降,但仍高于对照组（P＜0.01）。3.各浓度PD98059可明显抑制EGF促FL细胞增殖作用（P＜0.01）,且随着剂量的加大其抑制作用愈明显。4.不同浓度rhEGF刺激30 min后p-Raf、p-ERK1/2蛋白诱导表达灰度分析结果示rhEGF 1-60μg/L浓度组p-Raf、p-ERK1/2蛋白较对照组明显升高（P＜0.05）,尤以10μg/L浓度组的作用最强。而非磷酸化ERK 1/2的表达无明显变化。5.rhEGF浓度10μg/L刺激FL细胞后测定连续时间段（0 min,5 min,30 min,1h,2 h）p-Raf、p-ERK1/2蛋白诱导表达结果示刺激第5 min-2 h各时间段p-Raf、p-ERK1/2活性表达呈峰型曲线,其中第5 min时p-Raf、p-ERK1/2活性最高（P＜0.01）,随后各时间段p-Raf、p-ERK1/2活性开始下降。2 h后p-Raf表达的水平即明显下降到刺激前的水平,与对照组无明显差别（P＞0.05）:而2 h后p-ERK1/2表达的水平甚至低于刺激前的水平（P＜0.05）。6.与对照组比较,灰度分析结果示各浓度组PD98059（25,50,75μmol/L）可明显抑制rhEGF促p-ERK1/2蛋白诱导表达（P＜0.01）。且PD98059抑制p-ERK1/2蛋白的表达有剂量依赖性,随着PD98059剂量的加大,抑制p-ERK1/2蛋白表达的作用增强。7.与对照组比较,受不同浓度rhEGF刺激1 h后Bcl-2蛋白表达灰度分析结果示1-60μg/L浓度组Bcl-2蛋白表达较对照组明显增高（P＜0.05）;rhEGF 1-60μg/L浓度组p53蛋白明显下降（P＜0.01）。其中rhEGF 1μg/L浓度组的作用最弱,10μg/L浓度组的最强,两组之间比较有显著差异（P＜0.01）。8.以rhEGF 10μg/L的刺激浓度观测0 min,30 min,1 h,2 h,4 h五个时间段的Bcl-2蛋白诱导表达结果示30 min-4 h时间段的表达呈峰型曲线,以1h时间段的表达最高（P＜0.01）,随后开始下降。与rhEGF 10μg/L的浓度刺激后p-ERK1/2蛋白的表达水平比较,各时间段Bcl-2与p-ERK1/2的峰型变化曲线基本一致。结论EGF促FL细胞增殖、激活Ras/Raf/MEK/ERK信号转导通路及对Bcl-2、p53蛋白的表达有明显的剂量和时间依赖性作用。EGF浓度10μg/L是最强的刺激浓度,FL细胞对此浓度EGF的刺激具有自适应控制作用。1μg/L浓度的EGF可能是既发挥生理效应又较为安全的用量。第二部分:羊颌下腺表皮生长因子提取、纯化及生物活性鉴定的研究目的从山羊颌下腺分离、纯化具有生物学活性的EGF。方法1.羊EGF的提取、纯化:首先进行EGF的粗分离,称取山羊颌下腺（新鲜或冷冻）,解冻后剪去结缔组织,用剪刀剪成小块,用搅拌机搅碎,然后放入匀浆器匀浆,按比例加入冰醋酸（HAC）,操作在4℃冰浴中进行。50 000×g,离心30 min,抽取上清液。进行DEAE Sphacel阴离子交换柱分离,收集洗脱液,UV-280nm检测图分析吸光度,选出的管数做ELISA实验。并以0.2 M醋酸铵和EGF标准品做为阴性、阳性对照,以检测EGF活性成分。不加硫酸（在652nm处的读数）及加酸后（在450nm处读数）的结果分析。读数高、和EGF标准品读数接近为有EGF活性组份的可能,将这些组份合并后进行透析脱去盐分（透析袋分子量为3 500）,透析过夜。将透析好的组份分别用甘油（丙三醇）或聚乙二醇（分子量20 000）进行浓缩以除去水分。透析浓缩后的组份再次进行ELISA实验。将含有EGF成分的浓缩液过分子筛色谱（Sephadex G50）柱层析,根据层析图所示,选取对应的收集管再次进行ELISA实验,步骤同前,结果吸光度值高的几管与层析图中的一个峰所对应,因此该峰就是含有EGF的活性峰。2.对提取、纯化的羊EGF进行生物活性检测2.1 MTT法测定不同浓度羊EGF对人胚胎羊膜细胞FL的促增殖作用。2.2流式细胞术检测羊EGF促细胞增殖时细胞周期变化。3.纯化的山羊颌下腺EGF行SDS-PAGE电泳观测其可见的分子量条带位置。结果1.48小时后贴璧生长的FL细胞逐渐以多边形居多,而加入EGF后细胞以长条纺锤形居多。2.MTT法促增殖实验:结果显示不同浓度羊颌下腺EGF组（稀释倍数:1:100、1:500、1:1000）、rhEGF（10μg/L）组对FL细胞的促增殖率分别为20.90%、39.43%、24.90%和40.60%。与对照组比较,羊颌下腺分离的EGF可明显促进FL细胞的生长（P＜0.01）,以稀释1:500倍的羊EGF作用效果最强,其促FL细胞增殖率与人重组EGF比较无明显差异（P＞0.05）。3.流式细胞术:根据细胞实验中确立的最佳羊EGF稀释浓度观测流式细胞术中羊EGF对细胞周期的影响,与对照组相比较,结果显示作用48 h后,G₀/G₁期细胞百分比由71.1±1.9减少至60.3±2.2（P＜0.01）,S期细胞百分比由18.8±1.4增高至25.8±1.1（P＜0.01）,纯化的山羊颌下腺EGF显著刺激细胞由G₀/G₁期进入S期,使分布在S期的细胞数增加。3.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳:电泳结果显示在分子量6 kD处,可见明显的条带。结论从山羊颌下腺分离得到的蛋白质经鉴定为EGF,该EGF能明显促进FL细胞生长、显著提高细胞的S期细胞分数,为具有生物学活性的EGF。羊颌下腺可能成为外源性EGF的药源。